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过氧化氢诱导斜带石斑鱼肝细胞氧化损伤的转录组学研究

【摘要】:1.H_2O_2诱导斜带石斑鱼肝细胞氧化损伤模型的建立通过不同的过氧化氢培养浓度(0、100、200、400、600、800、1000μmol/L)和作用时间(2、4、6、8、12、24 h)探索适宜的斜带石斑鱼肝细胞氧化损伤浓度和时间,以建立的斜带石斑鱼原代肝细胞氧化损伤模型,并检测培养过程中肝细胞的数量和活性的变化。采用单因子完全随机设计实验,根据台盼蓝对死细胞拒染法利用血球计数板测定细胞活力及数量,并通过MTT法测定细胞存活率。结果显示,800μmol/L H_2O_2,作用8 h,斜带石斑鱼肝细胞的存活率降低至61.98%。2.H_2O_2对斜带石斑鱼原代肝细胞活性及功能的影响本研究采用斜带石斑鱼原代肝细胞模型,主要探究过氧化氢对原代培养的肝细胞氧化损伤机制的影响。通过测定不同培养时间下过氧化氢不同作用浓度的肝细胞或培养上清液中的超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、脂质过氧化物(LPO)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、过氧化氢酶(CAT)的变化,分析细胞生长代谢状态。结果显示,使用过氧化氢处理后其他各组与800μmol/L和1000μmol/L组相比显著降低了CAT、GSH-PX和SOD活性,显著升高LPO、MDA含量(P0.05),但是800和1000μmol/L组之间没有显著差异(P0.05)。结果发现:H_2O_2过氧化氢作用时间为8 h、作用浓度为800μmol/L,使斜带石斑鱼原代肝细胞产生了明显的氧化应激,该条件可作为建立斜带石斑鱼肝细胞氧化损伤模型的适宜条件。3.利用转录组学技术研究过氧化氢对肝细胞差异表达影响本研究以过氧化氢为刺激源诱导建立了斜带石斑鱼肝细胞氧化损伤模型,试验基于RNA-Seq技术对正常处理组(L-15)和对照组(800μmol/L H_2O_2)的斜带石斑鱼肝细胞进行测序,利用转录组学技术深度分析细胞内部基因的转录调控以及过氧化氢处理后细胞表型和功能的改变。结果显示,通过转录组数据分析发现,对83,802,103条原始reads的筛选和排除,拼接获得到了112,618条Unigenes,平均长度为957.45 bp,N50为1,687 bp。按照Blast等相关软件,对数据进行相关分析后,共得到功能注释基因110,560个。依据GO富集分析发现,差异表达基因主要被集中在代谢通路、细胞过程、生物调控等通路中,在KEGG pathway富集分析中结果显示,代谢通路涉及基因最多,有170个。两种水平下(过氧化氢处理组和对照组)共差异表达的基因共2,570个,其中上调的基因1,520个,下调的基因1,020个。结果显示,800μmol/L H_2O_2对斜带石斑鱼肝细胞的代谢和生物调控等相关基因表达产生影响。本实验对差异表达的基因进行后续分析及预测,为斜带石斑鱼生长代谢及疾病预防等方面的研究提供了丰富的数据来源。

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