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变构核酸适体探针在DNA激酶—磷酸酶高灵敏检测中的应用

【摘要】:核酸适体是通过指数富集的配体系统进化技术——SELEX筛选出的对于特定的靶标分子具有高特异性与亲和性的单链寡核苷酸序列。而变构核酸适体探针则是利用了核酸适体的高特异性高亲和力,并结合仿生变构效应设计出的可对各类靶标如离子、有机小分子、蛋白甚至细胞、组织等进行高灵敏生物分析检测的DNA分子探针。变构核酸适体探针具有灵敏度高、特异性强、受复杂的检测体系影响小、反应速度快等优点,并且可以根据不同的设计,定制化检测多种类型的靶标,体系兼容性强,应用范围广。本文改进了传统的发夹型变构核酸适体探针,设计了两种新型的双链变构核酸适体探针,实现了对T4多聚核苷酸激酶(T4 PNK)以及碱性磷酸酶(ALP)两种生物酶分子的高灵敏检测,证明了新型变构核酸适体探针对DNA磷酸化过程中的激酶、磷酸酶的检测具有良好的应用前景与临床诊断价值。本文的工作主要包括两个方面。首先,我们设计了新型双链变构核酸适体探针,探针主要由两部分组成,一部分是带有荧光团修饰的链霉亲和素的核酸适体,另一部分是与核酸适体相互补的DNA序列(cDNA)。我们将设计好的变构核酸适体探针应用于T4多聚核苷酸激酶的检测中,当体系中存在靶标分子时,变构核酸适体探针的cDNA的5'-OH基团被T4 PNK磷酸化,体系中的λ核酸外切酶识别磷酸基团后将cDNA降解,探针发生变构效应恢复核酸适体结构并与修饰有链霉亲和素的微珠相结合,使得微珠发出荧光,通过检测荧光信号的强度,对T4多聚核苷酸激酶进行高灵敏度的定量检测。本检测体系最低检测浓度可低至0.01 U/mL。接下来我们又针对在生物体系中与T4多聚核苷酸激酶作用完全相反的碱性磷酸酶进行了变构核酸适体探针的设计与检测。我们采用了类似的设计思路与检测体系,双链探针由互补的链霉亲和素的核酸适体与5'磷酸化的cDNA构成,当体系中不存在靶标分子ALP时,体系中的λ核酸外切酶将识别磷酸基团并将cDNA降解,探针发生变构效应恢复核酸适体结构并与修饰有链霉亲和素的微珠相结合,使得微珠发出荧光;而当体系中存在ALP时,cDNA的磷酸基团被去磷酸化,使得cDNA的降解被抑制,从而抑制探针的变构效应以及荧光探针与微珠的结合。通过检测荧光信号强度减弱的程度,即可对碱性磷酸酶进行高灵敏度的定量检测。本检测体系的最低检测浓度可低至0.012 U/mL。

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