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DNA非经典结构的小分子识别及应用研究

【摘要】:随着对核酸结构与功能的研究不断发展,G-四链体等非经典结构的DNA在分子识别领域引起了很多人关注。由于特殊的核酸结构对目标分析物具有高度的亲和力和选择性,因此在传感器的开发、药物输送、疾病的诊断治疗以及基因检测等方面都有普遍的应用。本文选用硫黄素T(ThT)、柯南因(COR)作为荧光探针分子,以含有脱碱基位点的G-四链体(G4-AP)、完整的G-三链体(G3)为研究对象,根据目标分析物与核酸结构的特异性结合,我们分别研发出了基于G4-AP选择性结合鸟嘌呤核苷(G)的软分子印迹传感平台及高选择性识别Cr~(3+)的G3传感平台。主要研究内容如下:1.具有脱嘌呤位点的G-四链体DNA作为软分子印迹传感平台分子印迹聚合物(MIPs)是一种多功能传感器平台,能够通过结构互补对目标分析物进行识别。然而,由于传统MIP具有刚性结构,会减弱聚合物和目标分析物结合之后产生的传导信号。因此,我们首次提出了软分子印迹聚合物的概念,通过使用具有完美折叠结构的DNA骨架作为软分子印迹聚合物(SMIP)来构建简易的生物传感器,即从形成G-四链体的序列(G4)中除去鸟苷来实现鸟苷SMIP识别。根据结构互补,这种具有脱嘌呤位点(AP位点)的G4折叠结构能够为鸟苷提供完美的印迹空穴,并在与鸟苷的结合之后发生构象变化,与此同时使用G4的特异性荧光配体进行信号读出。其次针对SMIP的印迹行为,对G4序列和AP位点的位置进行选择优化。研究发现,G4紧密结构和氢键残余部分的作用使SMIP在识别中具有高选择性,即除鸟苷以外,带负电荷的核苷酸以及其他核苷都不能与AP位点结合。此外,通过使用碱性磷酸酶对一磷酸鸟苷(GMP)进行水解,验证了实验中所提出的机理。因此,基于核酸的构象变化和发展完善的分子工程,我们相信这项工作将会激发更多人去探索核酸作为SMIP骨架的相关应用。2.基于G-三链体的Cr~(3+)传感富含G碱基的DNA序列可以折叠成不同的拓扑结构,其中以G-四链体(G4)为代表的核酸结构可作为多功能传感平台对目标分析物进行特异性识别。然而由于G4自身结构的完整性和稳定性会在一定程度上限制其在传感领域的灵活应用,因此我们首次尝试使用G4的中间体G-三链体(G3)来构建生物传感平台,即从G4序列当中剪掉三个G碱基片段以形成稳定的G3拓扑结构用以识别Cr~(3+),并与G4的传感特性进行比较。由于Cr~(3+)能够与DNA碱基及磷酸骨架结合,因此在具有裸露的磷酸骨架以及碱基的G3传感体系当中,Cr~(3+)能够迅速与G3发生特异性结合,与此同时使荧光配体释放到溶液当中,具有明显的荧光增强信号。研究发现,在一定条件下G4同样能够与Cr~(3+)结合,但是在动力学上表现出明显缓慢的传感特性,而G3在Cr~(3+)识别过程表现的更加优越。此外,通过使用抗坏血酸(AA)还原溶液中的CrO_4~(2-),也能够达到间接检测CrO_4~(2-)的目的。这一研究发现拓宽了非经典结构DNA作为传感平台的应用空间。

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