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西瓜AGPL1启动子果实特异调控机理的研究及在番茄遗传转化中的应用

【摘要】: 植物ADP-葡萄糖焦磷酸化酶(AGPase,ADP-glucose pyrophosphorylase)含有两个大亚基和两个小亚基。小亚基一般具有一个或两个异型体,在物种之间高度保守并在各组织中组成型表达;大亚基具有多个异型体并具有组织特异性表达的特征。刘敬梅等(2002)根据AGPase大亚基基因在西瓜(Citrullus vulgaris S.)果实中特异表达的现象,克隆到西瓜AGPase大亚基基因5′端1.8kb的序列AGPL1,发现该区段能引导报道基因在瞬时转化的西瓜果实和稳定转化的番茄果实中特异表达。本文对果实特异启动子AGPL1的调控机制进行了较为详细的研究。 首先通过引物延伸法对西瓜AGPL1启动子进行转录起始位点定位,发现TATA-box下游33bp处的A为该基因转录的起始位点。为了从AGPL1启动子中分离与果实特异性表达相关的cis元件,我们通过PCR扩增对该启动子进行了一系列5′端和3′端缺失突变,并与gus基因(β-glucuronidase)融合构建瞬时表达载体,利用基因枪介导的瞬时转化研究该启动子在西瓜果实中的表达调控。结果表明在-868~+433之间1301bp的启动子片段具有最大的驱动活性,并保持果实特异地驱动功能。随着启动子5′端的连续缺失,该启动子在西瓜果实中的活性表现出下降趋势并直至丧失功能。在AGPL1启动子下游的5′-UTR中长度为323bp富含AT(65%)的内含子序列(+136~+459)能增强启动子在果实中的驱动活性,但对特异性表达的模式没有显著影响。 将AGPL1启动子的系列缺失突变与GFP/RFP双荧光指示瞬时表达载体融合,在叶片中检测报道基因的活性。发现在-986~-959之间27bp和-464~-424之间41bp两个区段的缺失能引起该启动子在叶片表皮细胞中类似组成型表达,分别命名为PN1和PN2(putatively negative region 1 and 2);而这两个区段的下游序列-892~-868和-424~-368之间24bp、56bp相继从5′端缺失时又能引起叶片中驱动活性丧失,分别命名为PP1和PP2(putatively positive region 1 and 2)。将PN1和PN2与CaMV 35S基本功能启动子融合,瞬时转化后抑制了基本启动子在叶片中的驱动活性,最终确定PN1和PN2是抑制AGPL1启动子在叶片中活性的关键区段。 在凝胶迁移率分析实验中,PN1和PN2都能与西瓜叶片核蛋白结合形成特异的滞后条带,充分说明了这两个区段作为cis元件的调控作用;PP1和PP2与叶片核蛋白结合的现象充分验证了该正向调控序列的功能。根据上述现象,我们发现了与其他果实特异性启动子完全不同的调控机理,即西瓜果实特异性启动子AGPL1中存在cis元件抑制该启动子在果实外基因的表达,形成果实特异性的现象。为了更精确的分离cis调控元件中的核心碱基序列,我们通过4碱基内部缺失突变和单碱基突变的研究,发现PN1中起作用的cis元件序列为TC/TCAAAA,而且第11、12位的A是该元件的核心碱基;并在多种单子叶和双子叶植物中验证了该元件存在的普遍性。 为了充分验证西瓜AGPL1果实特异性启动子的功能,我们将该启动子与番茄红素β-环化酶基因RNAi融合构建植物表达载体,对番茄进行稳定的遗传转化。在转化阳性植株中验证了该启动子的果实特异性表达特性,并获得了高番茄红素积累的番茄果实。

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