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地衣芽孢杆菌ZJU12所产细菌素的分离纯化及其理化性质和基因克隆的研究

【摘要】:地衣芽孢杆菌ZJU12从土壤中分离出来,能产生细菌素,对多种革兰氏阳性细菌和植物病原真菌有拮抗作用,但是对除水稻白叶枯病原菌以外的革兰氏阴性细菌没有拮抗作用。地衣芽孢杆菌ZJU12所产细菌素对蛋白酶K和胰蛋白酶敏感。经100℃30分钟后仍具有拮抗活性,121℃15分钟后完全失活。地衣芽孢杆菌ZJU12的去菌液在pH2-9内具有拮抗活性,其中最适pH值在6.5左右。细菌培养去菌液经65%硫酸铵沉淀、DEAE-52离子交换色谱、Superdex75凝胶过滤色谱,并经过Tricine-SDS-PAGE和HPLC检测纯度,纯化得到一种分子量在3.5KDa左右的细菌素。利用LC-MS/MS方法得到序列分别为MHENVEEYLPMN,QPATEYLYNTDY LLPLLVDTY的三段肽链。经查询,没有发现与已知序列的同源性(NCBI)。纯化的抗菌物质也进行了N端测序,但没有得到氨基酸序列。地衣芽孢杆菌ZJU12的拮抗粗提物最高在0.8g/20g的剂量时对实验小鼠没有急性毒性。 通过测定乳酸链球菌素(nisin)和地衣芽孢杆菌ZJU12的去菌液(CFSb)对黄色微球菌、金黄色葡萄球菌和蜡样芽胞杆菌的抑菌作用,发现黄色微球菌比其他两种指示菌对乳酸链球菌素和去菌液更加敏感,表现出更低的最小抑菌浓度值。用棋盘稀释法和杀菌时间法测定发现nisin和CFSb具有协同作用。从部分抑菌浓度指数(FICI)来看,nisin和CFSb的联合对蜡样芽胞杆菌具有最显著的协同抑菌作用。nisin和CFSb在30分钟内就表现出杀菌作用,而它们的协同杀菌作用在4小时后才表现出来。 用Superdex 75凝胶过滤色谱的第二峰尖收集液免疫新西兰大白兔获得多克隆抗体。用斑点酶联免疫吸附试验法和目标抗原的拮抗作用法对抗原抗体反应的敏感性进行了分析,结果表明发现拮抗作用法比斑点ELISA具有更好的灵敏性。拮抗作用法只需抗原100AU/ml,抗体1:8000就能检测到抗体抗原反应,而斑点ELISA需抗原200AU/ml,抗体1:2000。经检测地衣芽孢杆菌EJU12没有发现质粒的存在。通过用拮抗活性法和抗体探针法筛选cDNA文库得到两个包含细菌素疑似基因的阳性克隆。另外,发现地衣芽孢杆菌ZJU12和乳酸链球菌之间没有相互拮抗作用,通过聚合酶链式反应法(PCR)以NisI部分

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