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西瓜转抗菌肽基因研究

【摘要】: 西瓜是人们夏季解热驱暑的重要果类蔬菜之一。在蔬菜作物中,它的栽培面积仅次于番茄位居世界第二,产量也高居世界的第三位。西瓜的抗病能力差,西瓜枯萎病是出尖孢镰刀菌西瓜专化型(Fusarium oxysporm f. sp. niveum(E.f.Smith)Synder et Hansen)引起的土传毁灭性病害,在西瓜苗期、伸蔓期至结果期都可发生,开花、坐果期和果实膨大期为发病高峰,随着西瓜逐年连作和重茬而发病日趋严重,成为西瓜生产上的限制因子。 抗菌肽是生物体内经诱导产生的一种小分子多肽,它富含阳离子氨基酸残基并且具有抗菌活性。葡聚糖酶基因和几丁质酶基因是目前报道最多的抗真菌有关的抗菌肽基因,它们在体外能够水解真菌细胞壁的两种主要成分—几丁质和葡聚糖,因而受到普遍关注。本文拟通过农杆菌介导法将葡聚糖酶基因和几丁质酶基因的双价载体导入西瓜常规品种中,得到转基因西瓜植株,以提高西瓜的枯萎病抗性,主要结果如下: 1.本试验以西瓜子叶为外植体,建立了具有高频率再生芽诱导率和生根率的完整的西瓜离体植株再生系统。该系统采用MS0+2mg/L 6-BA+0.2mg/L IAA的诱导不定芽培养基,子叶沿中间横切为二后,选近基端子叶外植体,16h/8h光/暗周期,26℃培养,获得了95%的高诱导率。具再生芽外植体移入伸长培养基(MS0+0.2 mg/L KT),获得1.5 cm左右大芽。大芽在生根培养基(MS0+0.1 mg/L NAA)中,获得了79%的生根率。这一系统的建立,为西瓜的遗传转化做好了准备。 2.在西瓜再生过程中进行了Kan浓度筛选,在Kan浓度0—125 mg/L的浓度梯度中,芽再生率随着Kan浓度升高而降低,达到125mg/L时,芽再生困难。本试验采用NptⅡ和GUS作为标记基因,用kan浓度100mg/L对转基因西瓜植株进行芽再生筛选。 3.对kan阳性植株进行GUS染色鉴定,部分植株叶片GUS染色后呈现蓝色,初步获得标记基因GUS在转基因植株中表达的证据。 4.应用PCR扩增方法对GUS阳性植株分别进行标记基因NPTⅡ基因,葡聚糖酶基因和几丁质酶基因特异扩增,发现GUS阳性植株均可扩增出基因大小 分别为240 bp,201 bp,178 bp的特异条带,与阳性对照质粒扩增DNA大小完 全一致。未转化植物没有扩增产物。结果表明,目的基因(聚糖酶基因和几丁质 酶基因)己经整合到西瓜基因组。

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