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组蛋白去乙酰化酶6在食管癌发生发展过程中的作用及其机制研究

【摘要】:第一部分:组蛋白去乙酰化酶6在食管癌中的表达及其机制研究目的:通过在临床组织中探讨组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)在食管癌中的表达情况及与预后的关系,进一步在细胞中对HDAC6在食管癌发生发展过程中的作用机制进行研究。方法:首先我们应用荧光定量聚合酶连锁反应(qRT-PCR)检测本院收集的46对食管鳞状细胞癌和其癌旁正常食管组织中HDAC6的表达水平,并结合随访资料对患者预后进行分析,判断HDAC6的表达量与患者预后的关系。其次在食管鳞状细胞癌细胞中加入HDAC6选择性抑制剂Ricolinostat(ACY-1215),观察(MTT比色法)其对食管鳞状细胞癌增殖能力的影响,并通过检测细胞周期和凋亡的变化观察其影响细胞增殖能力的原因。最后应用免疫印迹实验(Western Blot)对细胞中与上述周期和凋亡相关蛋白以及细胞核内组蛋白的修饰水平达进行检测,同时对其上游的相关通路进行探讨并通过AKT激动剂SC79进行回复实验验证,进一步明确HDAC6在食管癌中的作用机制。结果:食管癌标本中qRT-PCR结果显示HDAC6在癌组织和癌旁组织中表达未见明显差异(P = 0.517),然而通过生存分析得出HDAC6高表达预示着患者预后较差(P = 0.001)。食管癌细胞中加入ACY-1215后,细胞存活率随着药物浓度的增加逐渐下降,G2/M期阻滞和细胞凋亡逐渐上升,其原因在于HDAC6抑制后作用于PI3K/PDK1/AKT/mTOR通路和ERK通路蛋白以及H3K9等相关组蛋白,从而影响与细胞周期和凋亡相关的CyclinA2,CDK1,P21,P53,Bax,Bim,Bc12,Cleaved caspse3,Cleaved caspase9 和 Cleaved PARP 等蛋白的表达。结论:通过上述实验我们证实了 HDAC6与食管鳞状细胞癌发病相关,HDAC6通过PI3K/AKT和ERK通路及H3K9相关组蛋白促进食管癌的发生发展,为初步探讨其相关靶点在食管癌诊治中的应用价值提供了理论依据。第二部分:组蛋白去乙酰化酶6通过表观遗传在食管癌细胞中的作用机制探讨目的:第一部分研究中发现HDAC6的高表达与食管癌预后相关,且通过组蛋白和PI3K/AKT、ERK通路影响食管癌细胞的增殖和凋亡。本部分将从表观遗传上探讨HDAC6在食管癌细胞中的作用机制。方法:我们利用miRNA芯片技术对HDAC6抑制后食管癌细胞中miRNA表达谱测序,通过生物信息学分析筛选出靶基因为PI3K且表达上升的miRNA,应用qRT-PCR进一步验证HDAC6抑制后该miRNA表达是否上升,并在体外转染该miRNA抑制剂验证其与PI3K之间的关系。然后,我们通过检测细胞周期和凋亡的变化观察该miRNA对HDAC6抑制后细胞生物学功能的影响。最后,应用Western Blot对该miRNA在HDAC6抑制后所影响的PI3K通路蛋白及相关周期、凋亡蛋白的表达进行检测,进一步从表观遗传上明确HDAC6在食管癌中的作用机制。结果:通过miRNA芯片技术和生物信息学分析筛选出miR-30d在HDAC6抑制后表达升高,其靶基因为PI3K,并通qRT-PCR实验得到了进一步的证实。体外转染miR-30d抑制剂后,HDAC6抑制后出现的G2/M期阻滞和细胞凋亡比例明显下降,PI3K/PDKl/AKT/mTOR通路蛋白及细胞周期、凋亡相关蛋白的表达亦出现了相应的改变。结论:上述研究我们证实了 HDAC6可以通过miR-30d靶向PI3K促进食管癌的发生发展,为进一步探讨其相关靶点在食管癌诊治中的应用价值提供了理论依据。

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