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黏膜免疫佐剂对鸡黏膜和系统免疫反应机理的研究

【摘要】: 多数传染病通过消化道和呼吸道传播,研究与实践证明消化道黏膜免疫不仅在黏膜局部和其它黏膜组织产生免疫应答,还可引起全身性的体液免疫应答。但是,由于疫苗经过消化道时常受到消化液的降解,在应用中不得不增加了抗原的用量,使其在生产推广中受到一定的限制。近年来发现黏膜免疫佐剂能提高黏膜局部和系统的抗体水平,但佐剂种类繁多,作用效果各异,不适于推广应用。因此研究佐剂的作用特点和作用机理,开发高效、安全的黏膜免疫佐剂已成为亟待解决的问题。本研究选择大豆黄酮、CpG DNA、重组IL-2、乳酸杆菌和氟化钠五种不同类型的黏膜免疫佐剂为研究对象,分别与鸡新城疫弱毒苗配合口服免疫鸡后,系统研究了它们的免疫增强作用和机理,初步筛选出作用较好的佐剂进行配合,研制了两种新型复合黏膜免疫佐剂,并对其部分作用机理进行了研究,为口服免疫的推广和应用提供理论依据。试验分为以下五章: 1.不同类型黏膜免疫佐剂对鸡小肠局部免疫水平和系统免疫的影响 将大豆黄酮、CpG DNA、重组IL-2、乳酸杆菌和氟化钠五种不同类型的黏膜免疫佐剂,分别与鸡新城疫弱毒苗配合口服免疫鸡群后,应用组织学、免疫组织化学和免疫血清学方法研究动物黏膜局部和系统免疫水平的变化,初步探讨佐剂的作用机理。结果发现:(1)应用大豆黄酮、CpG DNA和重组IL-2与鸡新城疫弱毒苗配合口服免疫鸡后,小肠上皮内淋巴细胞(iIEL)的数量从免疫后第五周开始比单独应用新城疫弱毒苗的明显增加,到第七周时数量达最多。(2)添加黏膜免疫佐剂可以有效刺激黏膜局部肥大细胞的增加,并且其作用具有时间性。不同类型的黏膜免疫佐剂对肥大细胞的刺激作用也不同。乳酸杆菌对十二指肠肥大细胞的作用明显,而CpG DNA对空肠中肥大细胞的效果最好,CpG DNA和乳酸杆菌对Peyer’s斑处的肥大细胞作用均明显高于其它几种佐剂。(3)大豆黄酮、CpG DNA、重组IL-2和乳酸杆菌在整个免疫期内均可显著增加各段小肠中IgA分泌细胞数量,其中乳酸杆菌的效果最好,但是维持时间较短。(4)大豆黄酮和CpG DNA两种佐剂对黏膜局部sIgA水平都有明显的促进作用,而且持续作用较长。(5)大豆黄酮、重组IL-2、CpG DNA和氟化钠四种佐剂都可以显著提高血清中新城疫特异性抗体水平,增强全身体液免疫力,其中氟化钠的效果最好。 2.不同类型黏膜免疫佐剂抗原递呈机制的研究 为了进一步研究黏膜免疫佐剂对局部小肠的免疫机制,应用大鼠肠道原位结扎灌注模型观察大豆黄酮、CpG DNA和乳酸杆菌三种黏膜免疫佐剂对树突状细胞和MHCⅡ类分子的影响,研究不同类型的佐剂在小肠黏膜中的抗原递呈方式。结果发现:(1)CpGDNA和乳酸杆菌能够显著增加小肠树突状细胞的数量,刺激树突状细胞的活性,促进局部疫苗抗原的递呈,有效诱导局部黏膜的特异性免疫应答。(2)大豆黄酮、CpG DNA、乳酸杆菌组的大鼠空肠MHCⅡ类分子表达量在24小时内显著增加,表明黏膜免疫佐剂可有效刺激抗原递呈细胞对抗原的递呈。提示黏膜免疫佐剂可以增加树突状细胞的数量,提高黏膜局部抗原递呈细胞MHCⅡ类分子的表达。抗原递呈细胞的活性增强可以促进局部特异性免疫反应。 3.不同类型黏膜免疫佐剂对核转录因子的影响 为了研究黏膜免疫佐剂的信号转导途径,应用大鼠肠道原位结扎灌注模型观察大豆黄酮、CpG DNA和乳酸杆菌三种黏膜免疫佐剂对转录因子NF-κB的影响。结果发现:(1)CpG DNA可以在24小时内显著增加NF-κB蛋白的表达量,0.25小时作用最明显。表明在CDG DNA刺激机体后激活NF-κB的转录,诱导T、B淋巴细胞的反应,使机体的非特异性免疫能力明显增强。(2)乳酸杆菌在6小时内可极显著增加NF-κB蛋白的表达,表明乳酸杆菌刺激机体后也可激活NF-κB途径。(3)大豆黄酮组NF-κB蛋白的表达不明显。提示大豆黄酮对机体的刺激信号可能不通过NF-κB途径激活局部免疫反应。 4.复合黏膜免疫佐剂对鸡局部黏膜免疫和系统免疫的作用和机理的研究 根据对不同类型黏膜免疫佐剂免疫效果和作用机制的研究,选择大豆黄酮、CpGDNA、乳酸杆菌和氟化钠配制成两种复合黏膜免疫佐剂:大豆黄酮、乳酸杆菌和氟化钠配合组成复合佐剂Ⅰ,CpG DNA与氟化钠配合组成复合佐剂Ⅱ。将两种复合佐剂分别与鸡新城疫弱毒苗配合口服免疫鸡群后,应用组织学、免疫组织化学、分子生物学和免疫血清学方法观察动物黏膜局部和系统免疫水平的变化,研究复合佐剂的免疫增强效果和机理。结果发现:(1)两种复合黏膜免疫佐剂都能增加局部小肠iIEL、CD3~+T细胞和肥大细胞的数量,但对IFN-γmRNA表达水平影响不大,且在免疫后期IFN-γmRNA表达水平呈较低趋势。表明两种复合佐剂都可以有效提高黏膜局部细胞反应,不同肠段两者效果有差异,复合佐剂Ⅱ在空肠效果明显,维持时间长。(2)两种复合黏膜免疫佐剂都可以增加小肠局部IgA分泌细胞数量和肠内容物中SIgA抗体水平,但对粪便中SIgA抗体水平影响不明显。表明两种复合佐剂都能明显诱导小肠黏膜局部体液免疫反应,作用维持时间较长,在免疫末期作用仍较明显。(3)应用复合黏膜免疫佐剂可以显著增加血清中特异性抗体IgG、IgA的效价,表明复合佐剂与疫苗配合使用后能显著提高机体的体液免疫功能,其中复合佐剂Ⅱ对抗体的维持时间较长。 5.攻毒保护作用的研究 为了研究复合佐剂在生产实践中对鸡群的免疫保护效果,我们将两种复合黏膜免疫佐剂分别与新城疫疫苗配合通过口服免疫鸡群,当检测鸡群最高抗体效价≤41og2时,用新城疫F_(48)E_2强毒株模拟自然经口感染途径对鸡群进行攻击,探讨复合黏膜免疫佐剂应用后对鸡群的保护作用。结果发现:两种复合黏膜免疫佐剂与新城疫疫苗配合免疫的鸡在攻毒后第4天有2只出现轻微神精症状,其它正常;攻毒后第7天后全部正常,存活率为100%。单独应用新城疫弱毒苗免疫的鸡在攻毒后第4天死亡3只,存活率50%;攻毒后第5天死亡2只,存活率16.67%;攻毒后第6天全部死亡;对照组的鸡在攻毒后第四天全部死亡。表明抗体水平在临界保护线(≤41og2)时,使用添加复合黏膜免疫佐剂的疫苗免疫,仍然可以有效的保护鸡群,抵抗病毒的感染。提示新型复合黏膜免疫佐剂免疫效果和抗感染效果确实,适于家禽预防新城疫时饮水免疫应用。

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