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应用生物组学分析鉴定萝卜盐胁迫响应相关基因与miRNA

【摘要】:盐胁迫是农业生产中主要的环境胁迫之一,严重地影响了蔬菜作物的产量和品质。萝卜(Raphanus sativus L.)是原产于我国的一种重要根菜类作物,以膨大的肉质直根为主要食用器官。萝卜是一种中等盐敏感型的作物。前人对萝卜盐胁迫响应的研究主要集中在结构形态和生理生化方面,然而关于萝卜盐胁迫响应的关键基因和miRNA的分离鉴定研究尚未开展,导致萝卜盐胁迫响应的分子机制仍未完全阐明。因此,研究萝卜盐胁迫响应机制和遗传调控网络已成为当前萝卜生产面临的重要课题。鉴于此,本研究以萝卜高代自交系‘NAU-YH’为实验材料,从转录、转录后调控和蛋白水平系统研究萝卜盐胁迫响应的分子机制。主要研究结果如下:1.为系统分离鉴定萝卜盐胁迫响应过程中的miRNA及其靶基因,本研究构建了对照组(CK)和盐处理组(Na200)萝卜肉质根sRNA文库,利用高通量测序技术从这两个文库中鉴定到136个已知miRNAs (属于43个miRNA家族)和68个潜在的新型miRNAs (属于51个miRNA家族)。其中,49个已知和22个新型miRNAs在盐胁迫下是差异表达的。miRNA靶基因的预测和注释分析表明,这些盐胁迫响应的miRNAs主要通过调节特定的胁迫响应基因(如SPLs、ARFs、NF-Y和CSD1等)的表达在萝卜盐胁迫响应中发挥重要作用。进一步的功能分析表明,这些靶基因主要参与了信号感知和转导、离子平衡调节、基本代谢过程、次级胁迫响应和植物生长发育的调节等一系列生理生化过程。此外,通过RT-qPCR进一步对10个盐胁迫响应miRNA和5个对应靶基因的表达模式进行验证,发现所有被验证的miRNA的表达趋势与测序结果一致,且被验证的靶基因与其相应miRNA之间在表达趋势上存在负调控关系。本研究结果将对miRNA介导的萝卜盐胁迫响应调控网络提供新的认识,并有助于进一步解析根菜类作物耐盐性分子机制。2.为了在mRNA水平上分离鉴定萝卜盐胁迫响应的差异表达基因(DEGs),本研究通过构建对照组(CK)和盐处理组(Na200)萝卜肉质根cDNA文库,利用基于高通量测序的RNA-Seq技术进行萝卜盐胁迫响应的差异基因表达谱分析。共获得8709个差异表达基因,包括3931个上调表达和4778个下调表达基因。功能注释分析表明,许多差异表达基因可能参与了萝卜盐胁迫响应过程的几个重要方面,包括胁迫信号感知和转导、渗透调节、离子平衡和活性氧清除等。盐胁迫响应基因和miRNA的关联分析结果表明,36对miRNA与其对应的靶基因(miRNA-mRNA)在表达趋势上呈现出负调控关系。利用RT-qPCR对12个重要的盐胁迫响应基因进行表达模式分析,发现与RNA-Seq分析结果高度一致。另外,基于转录组序列与同源克隆技术,克隆得到了萝卜RsAPX1和RsSOS2基因cDNA序列。其中,RsAPX1开放阅读框(ORF)为753 bp,推导编码250个氨基酸;RsSOS2开放阅读框(ORF)长1329 bp,推导编码442个氨基酸。利用RT-qPCR进行了萝卜盐胁迫响应过程中RsAPX1和RsSOS2基因的表达特征分析。结果表明,RsAPX1在盐处理的中期阶段(12 h和24 h)和低浓度的盐处理下(50mM)的表达量显著提高,然而随着盐处理时间和浓度的进一步增加其表达受到明显抑制;RsSOS2在不同盐处理时间和不同浓度盐处理下的表达均受到一定程度的诱导。研究成果将有助于进一步解析盐胁迫响应分子机制,并为萝卜耐盐性遗传改良提供重要信息。3.运用基于iTRAQ技术的定量蛋白组学方法对盐胁迫下(0、Na100和Na200)萝卜肉质根蛋白组的变化进行分析。共在三个文库中鉴定到6342个蛋白质,其中分别鉴定到 851 (CKvsNa100)、706 (CKvsNa200)和 685 (Na100vsNa200)个差异蛋白。功能注释分析表明,这些差异蛋白主要参与了碳水化合物和能量代谢、蛋白质代谢、信号转导和转录调控、胁迫与抗性、转运、细胞壁与细胞骨架代谢、氨基酸代谢、脂质代谢等过程。运用RT-qPCR分析9个被鉴定到的蛋白相应的基因表达水平,其中四个基因在不同浓度盐处理下的转录和蛋白水平的表达改变相一致。另外,蛋白组与转录组、miRNA数据进行关联分析,共发现17对miRNA-mRNA-protein参与萝卜盐胁迫响应,并初步提出了萝卜盐胁迫响应的分子机制。

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