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水稻OsPLCl参与盐胁迫信号转导的机理研究

【摘要】:土壤盐渍化是环境中主要的非生物胁迫,威胁全球农业种植,严重影响农作物的生长发育和产量。高盐环境下导致植物体内产生渗透胁迫和离子毒害作用,植物为了抵御盐胁迫带来的伤害,在这种高盐环境下生存,逐步形成了一系列能够应对盐胁迫的机制。磷脂分子不仅是细胞膜的主要组成部分,还是细胞中重要的第二信使,调节植物生长发育,响应外界环境胁迫。磷脂酶包括磷脂酶A (PLA)、磷脂酶C (PLC)和磷脂酶D (PLD),能够水解细胞膜上的磷脂组分,产生一系列的产物信号分子,在细胞响应外界信号过程中起着重要的作用。根据作用底物的不同,植物PLC可以分为磷脂酰肌醇特异性PLC( PI-PLC)和底物非特异性的PLC( NPC )。传统的研究认为植物PI-PLC水解磷脂酰肌醇4,5-二磷酸(PtIns(4,5)P2)同时产生两个重要的第二信使分子1,2-二酰甘油(DAG)和1,4,5-肌醇三磷酸(InsP3)。PI-PLC信号途径在植物适应各种胁迫中有着重要的作用。水稻是典型的单子叶植物,含有四个PI-PLC基因,分别命名为OsPLC1-4。本研究利用OsPLC1敲除突变体和回补、过表达等转基因株系结合生理生化实验阐述了水稻OsPLC1在盐胁迫下的作用和相关的调控机制。主要的研究方法和结论如下:1 .鉴定了水稻中一个Tos1 7插入的OsPLC1突变体osplc1,发现缺失OsPLC 1的突变体的耐盐性显著降低。盐处理后osplcI比WT积累更多的Na+,呈现较高的Na+/K+比,死亡率增加,PLC总酶活降低。向突变体中回补OsPLC1可以将其耐盐性恢复至野生型水平,而过表达OsPLC1后植株的耐盐性得到了提高。说明OsPLC1在植物响应盐胁迫中有着不可忽视的作用。2.利用OsPLC1自身启动子融合GUS报告基因在水稻植株中进行组织表达模式分析,GUS染色显示OsPLC1在水稻的根、茎、叶、种胚中均有表达,并特异性表达在叶片表皮的保卫细胞中。3.在水稻原生质体和烟草表皮细胞中表达OsPLC1-GFP融合蛋白,荧光主要集中在胞质中,并且在盐诱导下荧光会有上膜的趋势。结合OsPLC1的抗体和免疫分析法检测植株胞质和膜上OsPLC1蛋白含量,证实在正常生长情况下,OsPLC1主要在细胞质中,当植株受到盐胁迫时,OsPLC1会迅速被募集到质膜上,水解质膜上的底物行使功能,产生下游信号分子,参与盐胁迫。4. OsPLC1具有典型PI-PLC的结构和水解功能。OsPLC1体外水解作用需要微摩尔级的Ca2+参与,并在100 μM时达到最高水解活性;将OsPLC1催化区保守部位重要的氨基酸突变掉能够大大降低OsPLC1活性。5. OsPLC1在体外同时具有水解PtdIns4P和PtdIns(4,5)P2的作用,且对PtdIns4P的水解活性高于PtdIns(4,5)P2;同时应用PtdIns4P生物探针观察OsPLC1在活体细胞内对PtdIns4P的水解情况,结果显示OsPLC1可以在植物体内水解质膜上的PtdIns4P。6.提取osplcl和WT植株总磷脂,通过薄层层析分离显示osplc1总PIP含量明显高于野生型,而在盐处理下只有WT出现明显的磷脂酰肌醇单磷酸(PIPs)含量下调,再次说明了 OsPLC1在植物体内对PtdIns4P的水解作用。在WT和osplc1的原生质体中添加PtdIns4P、PtdIns(4,5)P2、InsP2, InsP3, DAG能在一定程度上的增加盐处理后细胞的存活率,降低盐对它们的伤害,而添加磷脂酰丝氨酸(PS)时却没有任何效果。7.为了进一步了解水稻OsPLC1参与盐胁迫的调控机制,进行了 WT和osplc1中下游DAG和InsP3的含量的测定。盐胁迫下,OsPLC1的缺失直接影响了 DAG和InsP3的积累。通过在WT和osplcl中表达Ca2+探针NES-YC3.6来检测胞质内Ca2+的变化情况,发现在osplc1中胞内Ca2+响应灵敏度和波动幅度明显低于WT,OsPLC1的缺失会间接影响Ca2+调控的下游信号通路。利用钙离子染料Fluo-3AM检测不同磷脂孵育后的WT和osplc1的原生质体经盐处理后的Ca2+波动差异,发现经过PtdIns4P、PtdIns(4,5)P2孵育后,Ca2+波动幅度比对照都有了明显提高。综上,本研究表明了 OsPLC1可水解植株体内PtdIns4P和PtdIns(4,5)P2而更倾向水解PtdIns4P,直接调控下游InsP2、InsP3、DAG这些第二信使的含量变化,间接影响Ca2+响应外界压力的灵敏度和波动幅度,进而参与盐胁迫过程,帮助植株适应盐害,提高耐盐能力。

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