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地衣芽孢杆菌固态发酵产地衣素及风味活性物质对白酒品质的影响

【摘要】:地衣芽孢杆菌是中国白酒生产中影响风味品质的重要微生物之一,其产生的风味成分对白酒品质具有重要贡献。然而,关于地衣芽孢杆菌固态发酵的独特代谢机制及特征风味物质的研究较少。科学认识地衣芽孢杆菌在白酒生产过程中的代谢特征机理及对白酒风味化学的贡献机制,不仅对提升传统产业白酒品质具有重要的应用价值,更对认识中国传统酿造食品的微生物发酵机制和风味化学本质具有重要的理论意义。 本论文运用微生物代谢分析技术,分析了白酒特有固态发酵条件下地衣芽孢杆菌与模式菌之间的生理特征差异、挥发性代谢产物差异。采用液相分离手段结合飞行时间-四级杆质谱与核磁共振检测技术,分析出地衣芽孢杆菌固态发酵代谢组分中的特征产物地衣素;采用高灵敏质谱分析检测手段,鉴定出白酒体系中非挥发性特征成分地衣素。从化学分子作用层面,剖析了白酒中大分子地衣素影响小分子香气化合物挥发性的功能机制。在白酒生产中,利用地衣芽孢杆菌固态发酵高产风味活性物质的特性,提升了白酒品质。主要研究内容如下: (1)模拟白酒固态酿造特点,研究发现地衣芽孢杆菌MT-6与模式菌ATCC14580在高温好氧固态环境下表现出一定的代谢差异。MT-6在固态发酵条件下的挥发性成分总量显著性高于液态发酵条件。进一步采用热图分析发现,在固态发酵条件下,MT-6的挥发性代谢产物(C4化合物、吡嗪和挥发性酸等化合物)均明显高于液态发酵条件。基于固液态发酵条件下地衣芽孢杆菌的代谢产物存在显著差异,对其生理特征进行比较分析,发现地衣芽孢杆菌MT-6比模式菌ATCC14580具有更明显的聚集运动性能。地衣芽孢杆菌MT-6在低水活度(aw=0.960)条件下比在高水活度(aw=0.995)条件下具有更显著的聚集运动性能。固态发酵条件(低水活度)下有利于MT-6的聚集运动,细胞形态表现为长链状,细胞表面产生荚膜。 (2)基于地衣芽孢杆菌固态发酵特性,采用制备液相结合飞行时间-四级杆质谱和核磁共振分析手段,发现白酒中地衣芽孢杆菌固态发酵代谢产生特征化合物地衣素。针对白酒中酒精度高,目标物浓度痕量等困难,采用高灵敏度质谱分析检测手段,鉴定出白酒中的特征化合物地衣素。进一步研究发现,白酒中存在其他类脂肽化合物,对其鉴定分别为伊枯草菌素(Iturin)、丰原素(Fengycin)与枯草素(Surfactin)。鉴于白酒中其它脂肽类化合物的含量极低,采用超高效液相色谱结合串联四级杆质谱技术,建立了白酒中地衣素的定量方法。对不同香型白酒中的地衣素进行定量分析,酱香型的茅台、郎酒以及药香的董酒中地衣素的含量较高。董酒中的含量远远高于其他酒达到111.74μg·L-1,浓香、清香、老白干、凤香、兼香、芝麻香、豉香型等含量均低于1μg·L-1。 (3)鉴于白酒中地衣素为大分子化合物的化学本质,研究地衣素对白酒香气化合物的影响机制。采用顶空固相微萃取结合气相质谱和感官评价分析,发现地衣素能够显著地抑制白酒中小分子香气化合物(十碳以上的乙酯类、己酸和苯酚类化合物)的挥发性。在酒精饮料模拟体系中,研究发现地衣素浓度达到160μg·L-1时,有效的抑制了白酒中异味苯酚类化合物的挥发性,其中苯酚、4-甲基苯酚和4-乙基苯酚的挥发性分别降低了39%,45%和48%,愈创木酚和4-乙基愈创木酚的挥发性分别降低了30%和45%。通过分子间相互作用的热力学分析,发现地衣素与异味苯酚类化合物的作用力主要表现为氢键方式;采用1HNMR和2DNOESY实验分析,确定了地衣素的Val的C=O与4-乙基愈创木酚的OH的结合位点;运用分子对接手段,形象的表征了地衣素的Val的C=O与4-乙基愈创木酚的OH的结合方式。 (4)利用地衣芽孢杆菌MT-6固态发酵高产风味活性物质,应用于白酒生产过程中提升白酒品质。地衣芽孢杆菌的添加对生产过程中微生物群系影响,主要表现在芽孢杆菌的数量得到显著性地提升。地衣芽孢杆菌的添加对白酒生产环境中的水分、淀粉含量、酸度和氨基氮含量的影响不大,接种量1%样品中的还原糖含量显著的降低10mg·g-1,同时出酒率也显著地降低15mg·g-1。添加地衣芽孢杆菌的酒醅中风味成分得到明显的提升。添加1%地衣芽孢杆菌的头段酒样中,芳香族类和吡嗪化合物的含量变化最为显著,分别提高2.4倍和4.9倍。PCA分析结果显示,添加1%地衣芽孢杆菌的酒样风味成分存在明显差异,整体感官评价较好。

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