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基因工程技术改造地衣芽孢杆菌实现中温α-淀粉酶高效表达

【摘要】:中温-淀粉酶(BAA)是重要的淀粉液化酶。该酶的最适作用温度为60-70℃,在90-100℃可以实现快速灭酶,其使用不需要压力设备,适合应用于小型淀粉加工企业以及一些严格控制液化程度的工艺中。我国中温-淀粉酶的生产菌株为解淀粉芽孢杆菌BF7658及其突变株或重组菌,这些菌株具有优良的产酶性能,但在应用上存在一些缺点,其中之一是发酵温度较低。相对于解淀粉芽孢杆菌,地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)的生长及发酵温度较高,是实现高温发酵的理想宿主菌。本文以实验室前期构建的B. licheniformis CBBD302(简称D302)为基础,研究了其对来源于B.amyloliquefaciens M23的中温-淀粉酶的异源表达,主要内容如下: 1、用PCR方法扩增获得B. amyloliquefaciens M23中温-淀粉酶基因的成熟肽编码区片段BaA,与地衣芽孢杆菌表达载体pHY-WZX连接,获得重组表达载体pHY-WZX-BaA (缩写为pBaA),进一步转化B. licheniformis D302,获得重组菌D302/pBaA。重组菌D302/pBaA成功实现了中温-淀粉酶的异源表达,最高酶活达到294U·mL-1。 2、主要通过添加DNase抑制剂PLP的方法提高了B. licheniformis CBBD302的原生质体转化效率。在450μL地衣芽孢杆菌原生质体中,DNA加入量为10μg、PLP添加量0.8mmol·L-1时获得转化子数量最多。利用上述转化方法,通过线性DNA基因重组的方法获得了B. licheniformis CBBD302的淀粉酶基因缺失突变株B. licheniformisD402(简称D402)和淀粉酶基因与碱性蛋白酶基因双缺失突变株B. licheniformis D502(简称D502)。 3、用重组质粒pBaA转化上述地衣芽孢杆菌突变株,分别获得重组菌D402/pBaA和D502/pBaA。重组菌最适发酵温度均为42℃,相比B. amyloliquefaciens M23提高了8℃。重组菌D402/pBaA和D502/pBaA摇瓶发酵最高酶活分别为301和364U·mL-1,在30L罐发酵最高酶活分别达到527和619U·mL-1,可见碱性蛋白酶基因缺失可以明显提高中温-淀粉酶的表达水平。在优化的发酵条件下,重组菌D502/pBaA在30L罐发酵的最高酶活达746U·mL-1。 4、研究了不同菌株来源的BAA粗酶液的性质。重组菌D402/pBaA和D502/pBaA来源的重组中温-淀粉酶粗酶液在95℃保温20min后淀粉酶活性完全消失,保持了中温-淀粉酶易于灭酶的优良性能。重组菌D302/pBaA来源的粗酶液含少量地衣芽孢杆菌来源的耐高温-淀粉酶,在相同条件下不能完全灭酶。经纯化获得的重组BAA与解淀粉芽孢杆菌来源的BAA酶学性质一致。

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