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鼠抗人PD-1单克隆抗体的研制及其生物学功能研究

【摘要】:T、B淋巴细胞在机体免疫应答过程中需要两种信号的协同作用。第一信号为抗原与T细胞受体TCR的结合,第二信号为抗原递呈细胞上的协同刺激分子与T、B淋巴细胞上的受体结合。PD-1为T、B淋巴细胞表面受体,属于免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白,分子量约为50~55kD。在T、B细胞抗原受体激发后呈诱导性表达,也可表达于活化后的T、B细胞、单核细胞和髓系细胞,在胸腺及骨髓发育的特定阶段也可表达PD-1。PD-1与其两个配体PD-L1和PD-L2结合,在免疫应答中起着负性调控作用。为更好地了解PD-1分子在免疫调节中的作用,探讨PD-1作用的分子机制,本研究扩增了人PD-1基因,构建了重组逆转录病毒载体,筛选获得了能稳定高表达人PD-1分子的L929基因转染细胞,制备了抗人PD-1单克隆抗体,并对其生物学特性及对T细胞的影响进行了初步探讨。为进一步研究PD-1/PD-L信号在免疫调节中的作用,在临床肿瘤免疫、自身免疫性疾病以及移植免疫等疾病中的免疫干预,提供了实验基础和理论依据。 1、人PD-1 基因的扩增、在基因转染细胞PD-1/L929上的表达及其生物学功能的研究。采用PCR的方法,突变人PD-1全长基因的PstI位点,从本室构建的重组质粒pGEX-5X-3-PD-1中扩增出PD-1基因,并构建含PD-1基因的重组逆转录病毒载体,最终转染L929细胞,成功构建了稳定高表达PD-1分子的基因转染细胞株PD-1/L929,并探讨了PD-1/L929基因转染细胞对Mo-DC成熟的影响。结果显示,PD-1基因转染细胞可以促进DC的成熟,上调CD80和CD83的表达,但对CD86的作用不明显。此实验提示,PD-1/L929细胞可通过Mo-DC上的PD-L1分子产生逆向信号,从而介导生物学效应。 2、鼠抗人PD-1单抗的研制及其生物学特性研究。应用高表达人PD-1分子的PD-1/L929细胞为免疫原,常规方案免疫6~8周龄BALB/c小鼠。激发免疫后,将小鼠的脾脏细胞与小鼠SP2/0在PEG下融合,杂交瘤细胞经HAT选择培养获得。继而以PD-1/L929为筛选细胞,采用间接免疫荧光试验法,经流式细胞仪检测杂交瘤的培养上清中抗PD-1抗体的分泌。阳性克隆经有限稀释法多次亚克隆,至所有培养孔中的杂交瘤上清为阳性。实验先后共融合80块96孔板,筛选后最终获取2株持

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