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兔间充质干细胞体外培养及软骨形成的实验研究

【摘要】: 目的:研究碱性成纤维生长因子(bFGF)的不同浓度及同转化生长因子(TGF-β_1)联合作用,对兔间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs)增殖的影响,研究不同因子和培养时间对兔MSCs体外软骨形成的影响。观察MSCs与细胞支架的结合性。 方法:取兔股骨颈的MSCs经梯度离心,分离培养。观察原代细胞以及传代细胞生长特性。(1)取P_4代细胞,分7组,5组分别加入不同浓度(0,10,50,80,100ng/ml)bFGF的培养液(DMEM),2组为TGF-β_1、bFGF序贯加入和同时加入,培养4天后,MTT法测定各组MSCs吸光值,分析细胞增殖差异。(2)取P_3、P_5、P_7、P_(10)代细胞,在生长因子bFGF+TGF-β_1(20ng/ml)诱导下培养4天,甲苯胺蓝染色,RT-PCR半定量检测各代细胞Ⅱ型胶原的表达量。同时检测P_3代软骨细胞和经bFGF诱导P_5代MSCsⅡ型胶原的表达量。(3)将P_4代MSCs细胞接种到聚左旋乳酸(PLLA)支架上,体外培养1月,扫描电镜观察细胞在支架上的生长形态。 结果:bFGF对MSCs的促增殖作用随浓度增加而加强,100ng/mlbFGF达最大(P<0.05)。TGF-β_1(10ng/ml)和bFGF(10ng/ml)序贯加入大于80ng/mlbFGF的作用(P<0.05)。bFGF(20ng/ml)+TGF-β_1(20ng/ml)诱导MSCs的软骨形成,甲苯胺蓝染色呈异染性,RT-PCR检测Ⅱ型胶原阳性表达,灰度值比较,两种因子bFGF+TGF-β_1联用大于单因子bFGF作用;随培养时间的延长,该值增加,P_7代细胞达最大(P<0.01)。扫描电镜见细胞与支架结合呈多样性,细胞周围有基质出现。 结论:生长因子bFGF对MSCs的促增殖作用与浓度相关。两种生长因子(bFGF,TGF-β_1)间有相互促进作用。MSCs体外软骨生成随细胞培养时间的延长,存在一个峰值。细胞与支架能良好地结合。

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