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草鱼(Ctenopharyngodon idella)白细胞介素-8的克隆与鉴定

【摘要】:目的白细胞介素8(白介素-8/IL-8)是一个碱基-肝素结合蛋白,属于CXC趋化因子,它的主要作用是介导炎症反应。现已在多种鱼类中克隆到IL-8的基因,并对其功能进行了初步研究。草鱼(Ctenopharyngodon idella)不仅是我国的主要淡水养殖品种,也是世界第三大养殖品种,但草鱼抗病力差,易受各种致炎因子刺激发生炎症乃至死亡,严重影响草鱼养殖业的发展。本论文拟克隆草鱼IL-8的完整基因,并对其生物学功能进行初步鉴定。 方法首先,运用Rapid application of cDNA ends技术从草鱼中克隆IL-8cDNA全长序列,并通过原核表达质粒pET32a+表达IL-8融合蛋白。其次,运用Real-time PCR技术检测健康草鱼血液及12个组织的IL-8转录水平;同时经腹腔注射嗜水气单胞菌后4h,1d,3d,7d检测脑、心脏、肠道、中肾、脾脏、头肾、鳃、胸腺、表皮、尾鳍和肝脏等11个组织中的IL-8mRNA相对变化量。最后,利用扫描电镜技术和石蜡切片技术观察4h,1d,3d,7d时草鱼肠道结构的变化。 结果草鱼IL-8的cDNA全长序列为609bp,其中包含5’非编码区96bp、3’非编码区216bp和开放阅读框297bp;其开放阅读框共编码98个氨基酸,与人的IL-8相似性为45%,预测的三级结构与人的IL-8空间结构极为相似。草鱼IL-8全长DNA包括四个外显子,结构组成与其它物种的IL-8内含子外显子排列相似;利用表达载体成功诱导表达IL-8融合蛋白,与预期大小一致。健康草鱼12个组织及血液的IL-8转录水平检测结果显示,IL-8在各个组织中都有转录,其中肝脏中最高,鳍和表皮仅次于肝脏,肠道、中肾、脾脏、头肾、鳃、胸腺等免疫相关组织的转录水平也较高。腹腔注射嗜水气单胞菌后各组织中IL-8mRNA相对变化量检测结果显示,脑和鳍的IL-8无变化;心脏、肠道、中肾、脾脏、头肾、鳃、胸腺、表皮和肝脏等9个组织中的IL-8mRNA分别在4h或1d达到最高值;其中,免疫相关组织中表现更为明显,3d后下降到正常水平。嗜水气单胞菌感染刺激后草鱼肠道的显微结构变化表现为,肠道内皮细胞在4h时有出现空泡变性,1d时粘膜下层结缔组织充血,细胞肿胀,固有层淋巴细胞聚集,3d时淋巴细胞多聚集于粘膜下层结缔组织,7d时肠道组织基本恢复正常。肠绒毛超微结构显示,肠道绒毛的破损在3d时最为明显,7d时基本恢复正常。 结论本研究成功克隆并表达了草鱼完整的炎症细胞因子IL-8,该基因在草鱼体内呈组成性表达;致病菌刺激后的免疫相关组织中IL-8转录水平分别在4h或1d达到最高峰,3d后下降到正常水平;肠道组织在致病菌刺激3d后的炎症反应达到高峰,7d后恢复正常,初步证实了IL-8与草鱼炎症反应有关,参与了草鱼体内的免疫调节。

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