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草鱼细胞色素P4503A和孕烷X受体基因表达分析及其功能初步研究

【摘要】:细胞色素P450(CYP)是动物体内代谢药物的重要酶系,其亚型细胞色素P4503A(CYP3A)是动物肝脏、小肠和肾脏中含量最多的P450酶系,参与大多数药物的生物转化;其亚型CYP1A也参与部分药物的生物转化, CYP1A和CYP3A均能被药物诱导或者抑制。孕烷X受体(PXR)属于核受体超家族(NR)的NR1Ⅰ家族,其作为药物代谢的关键转录调控因子,参与CYP3A的诱导表达。关于鱼类CYP3A表达稳定阶段研究,CYP3A经由其转录因子PXR调控共同参与药物代谢研究报道甚少。 本文首先通过生物化学和分子生物学相结合的方法,先对CYP3A基因进行克隆并分析其结构功能域,检测其组织中表达丰度;再克隆了CYP3A转录因子PXR基因部分序列,检测其组织中表达丰度;其次,研究在草鱼体外最佳诱导模型中,CYP3A在mRNA和酶活性水平与时间动态变化的相关性,确定了CYP3A在鱼类中稳定表达阶段。在药物处理条件下,对PXR基因与CYP3A表达量差异进行研究,分析了CYP3A酶活性-CYP3A mRNA-PXR mRNA三者间相关性。用初步建立的诱导平台,氧氟沙星(OFLX)作为CYP3A的底物和诱导剂,验证CYP3A参与OFLX代谢过程中,其稳定表达阶段和CYP3A酶活性-CYP3A mRNA-PXR mRNA三者间相关性。全文主要研究结果如下: 一草鱼CYP3A和鲫鱼CYP1A基因克隆、序列分析及mRNA表达差异 根据GenBank中斑马鱼和虹鳟的CYP3A基因序列,设计保守区域的简并引物,通过PCR扩增获取CYP3A基因部分保守序列。根据CYP3A已获序列再设计引物,获取开放阅读框,然后,采用3' RACE法获取CYP3A序列末端;设计qRT-PCR引物,用SYBR荧光染料检测CYP3A mRNA组织表达差异。在此基础上,以鲫鱼CYP1A为参照,分析不同鱼类不同亚型基因结果特征。实验结果表明:⑴本研究得到草鱼CYP3A部分cDNA核苷酸序列为1849bp,包含保守编码区、3'UTR序列。开放阅读框序列长1542bp,编码513个氨基酸和一个终止密码(TAA),编码区包括信号肽(29aa)。⑵分析草鱼CYP3A主要结构域,其包含3个跨膜螺旋区,9个磷酸化位点,6个底物结合位点、1个血红素蛋白结合区和含1个半胱氨酸(Cys,C—448aa)的亚铁-血红素配体结合位点;而鲫鱼CYP1A基因结构特征,仅包含1个跨膜螺旋区,其含6个磷酸化位点,1个血红素蛋白结合区和含1个半胱氨酸(Cys,C—454aa)的亚铁-血红素配体结合位点。⑶应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测草鱼9种组织CYP3A mRNA相对含量,其表达丰度依次如下:前肠﹥肝脏﹥肾脏﹥鳃﹥肌肉﹥后肠﹥性腺﹥心脏﹥脾脏。其中,前肠、肝脏和肾脏是其主要表达部位,而其他各组织表达量较弱。同样方法检测鲫鱼9种组织CYP1A分布情况,其表达丰度依次如下:肝脏﹥前肠﹥鳃﹥肾脏﹥后肠﹥性腺﹥心脏﹥肌肉﹥脾脏,其中,肝脏、前肠和鳃是其主要表达部位,而其他各组织表达量较弱,CYP1A基因主要表达组织与参与药物代谢部位相同。药物代谢酶各亚型在组织中的分布与其参与药物代谢的主要部位相关。 二草鱼PXR基因克隆、序列分析及mRNA表达差异 根据GenBank中斑马鱼和虹鳟鱼类的PXR基因序列,设计保守区域的简并引物,通过PCR扩增获取PXR基因部分保守序列。设计qRT-PCR引物,用SYBR荧光染料检测PXR mRNA组织表达差异。实验结果表明:⑴本研究得到草鱼PXR部分cDNA核苷酸序列为509bp和推导169aa序列。⑵应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测9种组织PXR mRNA相对含量,其表达丰度依次如下:前肠﹥肝脏﹥肾脏﹥鳃﹥肌肉﹥后肠﹥性腺﹥心脏﹥脾脏。其中,前肠、肝脏和肾脏是其主要表达部位,而其他各组织表达量较弱。根据结果显示PXR与CYP3A基因在鱼体组织中表达部位基本一致。 三利福平和氧氟沙星对草鱼肾细胞的毒性实验 细胞的传代培养、冻存与复苏采用实验室常规方法。细胞中蛋白含量检测采用BCA法。采用MTT法分析了利福平在浓度为10-、20-、40和80μM,孵育时间为1-、2-、4 -、6-、8-、10-、12-、24-、48-和72 h;氧氟沙星在浓度分别为25-、50-、100-、200-、400和800μM,对草鱼肾细胞作用1-、2-、4-、6 -、8 -、10 -、12-、24和48 h之后,其结果表明肾细胞中选择RIF浓度为40μM和细胞孵育时间为1~24 h,作为最佳诱导模型进行后续实验,OFLX选择50μM和细胞孵育时间为1~24 h作为最佳条件进行后续实验,能对后续研究利福平和氧氟沙星在肾细胞中最佳代谢时间和浓度提供依据。 四最佳诱导模型CYP3A基因转录和酶活性检测 为了确定CYP3A在草鱼肾细胞中主要诱导及稳定表达阶段,本研究从CYP3A基因转录水平和酶活表达水平进行测定并评价。实验中使用CYP3A指示酶红霉素-N-脱甲基酶(ERND),采用分光光度计法检测CYP3A酶活性;设计qRT-PCR引物,采用SYBR荧光染料检测CYP3A mRNA表达差异。实验结果表明:CYP3A转录水平在2h诱导量提高,而酶活性则在4 h开始升高,两种水平间具有时间差异性,而CYP3A转录水平先于酶活2 h表达;RIF对CYP3A转录水平诱导效应显著强于酶活性水平诱导,这很可能反映了RIF诱导CYP3A表达是作用于转录水平的基因调控来影响酶活性。 五CYP3A与PXR mRNA表达及CYP3A酶活性三者相关性 RIF诱导后,CYP3A转录水平在2 h被诱导基因上调,而PXR则至10 h开始上调,此结果显示出CYP3A和PXR的基因转录水平上调呈现时间先后顺序。推断出PXR与药物结合后,受到药物刺激经时间发生反应,再参与后续的一系列作用;也显示出RIF与PXR结合后能激活PXR,并经由PXR这一转录调控因子参与激活并诱导CYP3A mRNA表达,不直接作用于翻译后酶活性,CYP3A酶活性主要是通过转录水平上调而达到活性增强的效果。 六氧氟沙星、CYP3A和PXR相关性 氧氟沙星(OFLX)孵育CIK,研究其时间动态过程中CYP3A与PXR量变相关性。用分光光度法测定CYP3A酶活性,用实时定量PCR检测CYP3A和PXR基因表达量。实验结果表明:⑴CYP3A酶活性在氧氟沙星处理后4 h开始提高,达致平台期后处于稳定阶段,而CYP3A mRNA在孵育10 h后开始开始上调。⑵PXR mRNA基底水平表达量较低,在OFLX孵育6~8 h后,逐渐上调,其mRNA开始上调时间先于CYP3A mRNA发生。由此推断整个药物代谢过程首先是OFLX经与PXR结合,然后其结合复合物作为转录调控调控因子参与激活CYP3A诱导表达。⑶结果显示氧氟沙星既是CYP3A代谢底物又是CYP3A一种诱导剂。

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