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CRISPR/Cas9系统在基因组DNA片段编辑中的应用及DNA切割断裂末端连接机制研究

【摘要】:近些年,通过ZFN、TALEN和Cas9核酸酶引入靶向特异双链断裂促进基因组编辑的技术迅速发展起来。尽管ZFN和TALEN技术很强大,但由于它们操作的复杂性限制了它们的广泛应用。然而,CRISPR系统具有设计简单和操作方便等巨大优势,成为最有竞争力的基因组编辑技术并得到广泛的应用。伴随着人类基因组计划和DNA元件百科全书项目的完成,科学家发现了大量人类基因组中的DNA调控元件,并且发现基因组上有DNA片段反转和重复等结构多样性。发现困扰人类健康的癌症细胞中频繁存在DNA片段重排。所以利用CRISPR进行有效DNA片段编辑的遗传操作方法对于研究基因组中调控元件、基因组结构多样性和进行疾病研究具有重要意义。在第二章中,通过CRISPR/Cas9系统用两个sgRNAs在人细胞系和小鼠基因组中进行调控元件和基因簇的DNA片段编辑。在小鼠和人细胞系中实现了35bp到807480 bp DNA片段的反转和删除。同时,在两个sgRNAs介导下Cas9切割形成的两个双链断裂之间通过跨等位基因重组实现了DNA片段重复。这种方法操作简单,费时少,效率高。此外,通过靶向PCDH基因簇的四个sgRNAs,在人细胞系中检测到了PCDH?、?、?基因簇复杂的组合型反转、重复和删除,所以在多sgRNAs进行编辑时也可以有较高的DNA片段编辑效率。最后,成功实现了DNA片段反转和删除小鼠的生殖系遗传,获得了DNA片段反转和删除F1代小鼠。利用F1代小鼠和CRISPR单克隆细胞系进行了PCDH?基因簇中调控区的功能鉴定,发现了PCDH?基因簇中的调控区在调控Pcdh?基因簇上的新角色。总之,这种有效的CRISPR编辑DNA片段的方法对于研究基因组中调控元件、基因簇和基因组多样性具有重要意义。在第三章中,在DNA片段删除过程中,发现干扰alt-NHEJ细胞修复系统中的CtIP基因表达可以有效地提高DNA片段删除接头的精确连接效率,进而实现精确的DNA片段删除;然后通过CRISPR方法获得CtIP基因突变的细胞系,在CtIP基因突变的细胞中也可以有效地提高DNA片段删除接头的精确连接效率;发现抑制CtIP功能的小分子药物3-AP也可以提高DNA片段删除接头的精确连接效率。在研究DNA片段删除接头时,通过桑格尔测序和高通量测序,发现干扰了负责对DNA断裂末端进行切割的关键酶基因CtIP的DNA片段删除接头处的DNA碱基删除突变明显减少,所以可以有效地实现精确的DNA片段删除,对于研究细胞内的NHEJ修复机制有较大帮助。然而,在研究DNA片段反转时,DNA片段反转接头具有独特的连接方式,一侧具有较高比例的精确连接,另一侧具有较高比例的碱基插入造成的不精确连接。通过调控负责对DNA断裂末端进行切割的关键酶基因CtIP不能实现精确的DNA片段反转,可以通过特定的PAM组合(NGG-NGG和CCN-CCN)实现一端精确的DNA片段反转。总之,通过干扰CtIP基因表达或使用小分子药物3-AP可以提高精确的DNA片段删除效率;通过特定的PAM组合实现精确的DNA片段反转。通过DNA片段编辑,也可以较好地研究细胞修复系统,为至今还有很多不清楚的细胞修复系统研究提供有利手段。

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