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DNA磷硫酰化修饰蛋白DndEi的功能和磷硫酰化修饰频率的研究

【摘要】:DNA磷硫酰化(PT)修饰是DNA骨架磷原子上非桥接的氧原子取代为硫的修饰,这是首次发现的位于DNA骨架上的生理修饰,也是首次在DNA中发现硫元素。细菌中的DNA磷硫酰化生理修饰由DndA-E组成的蛋白复合体负责完成,各个蛋白的功能已经得到了研究,但是修饰过程的生化机制依然不清楚。此外,高通量测序技术揭示了磷硫酰化修饰在基因组DNA上的分布规律,但是基因组上各个位点的修饰频率还不清楚。为此,本论文对DNA磷硫酰化修饰的生化机制和修饰频率进行了研究。首先,通过对鸭疫里默氏杆菌修饰蛋白DndEi的功能研究,揭示了DNA磷硫酰化修饰需要DNA解旋酶和ATP酶参与的生化机制。DndEi是一种新型的磷硫酰化修饰蛋白,相对于传统的DndE蛋白,它多了一个结构域。体外生化实验表明该结构域具有DNA解旋酶活性,体内缺失该结构域会导致磷硫酰化修饰活性的丧失,表明解旋酶活性是DNA磷硫酰化修饰必需的。DndEi还具有ATP酶活性,并且它的ATP酶活性能够被含有GAAC/GTTC序列的DNA促进,暗示着DNA磷硫酰化修饰是一个需要ATP水解提供能量的酶促反应。其次,对大肠杆菌基因组DNA磷硫酰化修饰的频率进行了定量研究。开发了一种定量检测DNA磷硫酰化修饰频率的方法:用碘对样品进行处理,磷硫酰化修饰的DNA会在修饰位点处发生双链断裂从而实现和未修饰DNA的区分;利用微滴式数字PCR对两种DNA分子绝对定量,然后计算得到磷硫酰化修饰频率。利用该方法对大肠杆菌B7A基因组上8个位点的修饰频率检测,发现这些位点的修饰频率都在50%以下且有些位点未被修饰,说明DNA磷硫酰化修饰是一种不完全修饰。此外,对大肠杆菌B7A不同克隆以及同一个克隆不同生长时期的修饰频率检测,发现磷硫酰化修饰存在动态变化的特征。本论文发现磷硫酰化修饰需要DNA解旋酶和ATP酶的参与,加深了对修饰的生化机制的理解;开发了一种定量检测磷硫酰化修饰频率的方法,实现了基因组DNA磷硫酰化修饰频率的精确定量,揭示了磷硫酰化修饰是不完全修饰和动态修饰的特性,为阐明DNA磷硫酰化修饰的生物化学机理和生物学功能奠定了基础。

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