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干细胞源性视泡样结构电镜观察及组织工程化视网膜构建初探

【摘要】:视网膜退行性疾病,如老年性黄斑变性和色素性视网膜炎等,主要累及感光细胞和视网膜色素上皮细胞,导致感光细胞退行性变,最终造成患者的失明,但尚无有效治疗方法。业已开展的基因治疗和抗血管生成治疗等研究,仅能延缓病情的发展。然而,近年来开展的细胞替代治疗研究为这些疾病的治疗带来了希望,人们正在尝试不同种类细胞的移植,包括胚胎干细胞、视网膜干细胞、诱导多能干细胞等,以期实现病变视网膜再生的目的。但细胞移植治疗存在诸多问题,包括移植细胞的存活率低、难与宿主细胞整合等。随着组织工程学的发展,人们开始考虑用组织工程的方法来促进移植细胞的存活、分化及与宿主视网膜的整合。本课题以构建组织工程化视网膜为目的,从人胚胎干细胞的诱导分化入手,对体外形成的视泡样结构的超微结构特点进行比较分析、构建不同类型PLGA支架,并观察视网膜前体细胞在支架上的生长情况,为组织工程化视网膜的构建提供参考依据。实验采用改良的培养方案,将人胚胎干细胞诱导分化形成早期视泡或视杯样结构,分化出视网膜细胞和视网膜色素上皮细胞,并尝试通过改变培养液的成分,实现视网膜细胞的定向诱导分化。通过免疫荧光方法来鉴定诱导分化的细胞类型;进一步通过透射电镜对视泡或视杯样结构进行观察,以了解其内部细胞分裂分化情况。以PLGA为材料,通过溶剂铸造方法,制造得到PLGA支架。将诱导分化得到的视网膜细胞作为种子细胞种植到PLGA支架上构建出“视网膜细胞-支架”复合物,观察细胞生长发育的情况,对种子细胞的类型、支架的材料和结构进行分析。体外培养人胚胎干细胞,进行诱导分化至7周,可以观察到人胚胎干细胞克隆边缘光滑,色泽光亮;克隆内细胞核质比高,分布均匀。而已经分化的克隆形状扁平,中央部位色泽加深,克隆内核质比降低。诱导分化的细胞经历EB球、rosette样结构、视泡或视杯样结构,可分为无色素、有色素等类型。免疫荧光结果显示,人胚胎干细胞被成功诱导分化为Chx10+的神经视网膜细胞球、Mitf+的色素视网膜细胞球和混合细胞球。透射电镜观察了来源于不同品系干细胞诱导分化至7.5周至13周的细胞球。发现大部分细胞中央有空腔或裂隙,类似眼胚胎发育时期的视泡或视杯样结构,并在近腔侧球壁可见少数正在分裂中的细胞,还可见少量处于凋亡中的细胞,与在体神经上皮细胞发育模式相近。分化早期,球壁细胞有多层,细胞排列较密集,但细胞间可见缝隙;细胞核呈圆形或不规则形,核仁明显,可见分散的异染色质;细胞有短的突起,细胞质较少。分化晚期细胞球,部分球壁仍有多层细胞,细胞形状多样,近腔侧细胞呈长柱状,偶见伸入腔面的纤毛样结构或膜盘样结构,提示为分化中的感光细胞;细胞出现明显分化,细胞质增多,含有较多粗面内质网、线粒体等细胞器;细胞突起多而长,有些细胞间可见细胞连接样结构,部分突起中可见突触囊泡样结构。部分球壁变得很薄,与厚壁部分分界清晰,仅由单层立方或扁平细胞构成,细胞之间排列紧密,细胞之间可见连接结构;细胞核变扁平,细胞质内有非常丰富的细胞器,近腔侧可见较多的黑素颗粒,颗粒大小不一,染色深浅不一,呈圆形或椭圆形,大多由呈同心圆排列的板层状结构,提示为不同发育阶段的黑素颗粒;细胞游离面有密集排列的微绒毛样结构。通过溶剂铸造方法得到了两种不同孔结构的PLGA支架,即取向型支架和非取向型支架。扫描电镜显示支架的最大孔径在100μm左右,孔径之间有25μm左右的孔径相通。我们将支架切割成厚约1mm,大小在5×5mm左右的薄片,将诱导分化至7周的人胚干细胞种植在支架上,每个支架上细胞数量在1×106。将“视网膜细胞-支架”复合物联合培养两天,扫描电镜观察显示,在取向型支架上几乎见不到细胞生长,而在非取向支架上细胞密度大,生长状态良好,且伸出许多突起,彼此间建立了广泛的连接。这可能与取向支架孔隙大且贯穿支架两面,种植细胞大量漏出有关,而非取向支架孔隙虽大,但半球形状使其可以装载更多细胞且不存在细胞大量漏出的情况。我们还可以看到细胞在非取向支架上的分布有两种情况。一种类似视网膜色素上皮细胞,呈片状分布;另一种形成细胞团。这可能与种子细胞中包含不同种类视网膜细胞有关。我们现有的诱导方案可以成功得到神经视网膜细胞球和色素视网膜细胞球,且诱导分化的细胞可以形成色素颗粒、膜盘等具有视网膜细胞特征的超微结构,提示这些细胞正在朝向特定的视网膜细胞分化,可用于构建组织工程化视网膜。通过溶剂铸造技术得到的PLGA支架,具有一定的生物相容性。以1×106的数量将细胞种在大小5×5mm、厚约1mm的PLGA支架上后,可观察到细胞生长状态良好,有两种分布状态,能建立广泛的联系。非取向型支架由于能装载更多细胞而优于取向型支架。

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