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大鼠视网膜Mǖller细胞在机械牵张下基因变化的研究

【摘要】:视网膜在很多疾病状态下都会受到力的牵张作用,比如病理性近视,玻璃体后脱离,增殖性玻璃体视网膜病变等。这些力的牵张作用,在疾病的病理生理过程中扮演重要角色。Muller细胞作为视网膜中主要的胶质细胞,对维持神经元的稳态和代谢平衡都有非常重要的作用,几乎参与各种视网膜损伤和疾病过程。已经有研究初步提示Muller细胞在生物力的牵张作用下有一系列细胞生物学效应。但其具体的分子生物学效应及在视网膜疾病发病机制中的作用还有待进一步深入研究。本研究通过观察Muller细胞,在持续性机械牵张作用下基质金属蛋白酶2(Matrixmetalloproteinase-2,MMP2)基因和蛋白水平的变化;在周期性机械牵张作用下全基因组的变化,进一步揭示了Muller细胞复杂的生物力学效应,为解释和进一步研究众多有视网膜受力的视网膜疾病的分子生物学机制提供了新的思路。第一部分持续性机械牵张作用下大鼠视网膜Muller细胞MMP-2表达变化的研究目的 观察持续性机械牵张对大鼠视网膜Muller细胞MMP-2分泌的影响。方法 原代培养SD大鼠Muller细胞,选取2-3代生长良好的细胞种到底部由弹性硅胶膜组成细胞培养板中,给予幅度为15%,持续时间为24h的持续机械牵拉。用Real-time PCR, Western blot分别检测Muller细胞胞内MMP-2基因和蛋白的表达变化,用Western blot 和t ELIS A检测分泌至Muller细胞培液中MMP-2的含量,用凝胶酶谱检测培液中有活性的MMP-2的含量。结果Muller细胞经过24h牵拉,胞内MMP-2的mRNA和蛋白水平有明显提高,胞外MMP-2总蛋白及其活性形式的含量亦有明显增加。结论 持续性机械牵张能够促进Muller细胞MMP-2的表达和分泌,这为解释众多有视网膜牵引因素的视网膜疾病的视网膜重塑机制提供了新的思路。第二部分周期性机械牵张作用下大鼠视网膜Muller细胞全基因组表达变化的研究目的 观察在周期性机械牵张刺激下Muller细胞全基因组的表达变化。方法 原代培养SD大鼠Muller细胞,选取2-3代生长良好的细胞种到底部由弹性硅胶膜组成细胞培养板中,分别给予1h和24h的周期性牵拉,牵拉幅度均为15%,收集细胞的RNA进行基因芯片杂交。芯片结果用GeneSpring基因芯片分析软件进行分析,用聚类分析和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)数据库注释基因的功能和信号通路。筛选出的感兴趣基因进一步用Real-time PCR验证。结果 基因芯片结果分析显示机械牵拉1h和24h后,与对照组相比,Muller细胞分别有532和991个基因有表达差异(t-test, p0.05)。在这些差异表达的基因中,在1h和24h分别有56和62个表达差异在2倍以上。筛选出一些与刺激应激(如,Egr2,IL6)),细胞增殖(如,Areg,Atf3),组织重塑(如,PVR, Loxl2)和血管新生(如,Epha2,Nrn1)相关的基因,进一步用PCR的验证结果与芯片结果吻合度很高。KEGG信号通路分析显示在两个时点MAPK信号通路均有明显的表达变化。结论 在周期性机械牵张下Muller细胞的大量基因发生了表达变化,涉及众多的分子信号通路。这些结果提示了Muller细胞复杂的生物力学特性,为众多有视网膜牵引因素的视网膜疾病分子机制的解释和进一步研究提供了新的思路。

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