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地衣芽孢杆菌转化薯渣与汁水效能及其代谢机理研究

【摘要】:马铃薯淀粉工业废弃物的处理一直是困扰马铃薯淀粉企业的重大难题。大量的马铃薯废渣(薯渣)和废水(汁水)造成的污染正严重危害着环境。液态发酵薯渣与汁水生产细胞蛋白的生物技术,既能解决环境污染的问题,又能通过资源化给企业带来额外效益,是一种可实现工业化的高新技术。目前,进一步降解薯渣与汁水中的纤维素,提高细胞蛋白产量的研究备受关注。本文通过改进并优化原有的发酵工艺和微生物群体动态的分析,对该技术中的重要菌种地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)转化薯渣与汁水效能进行了研究;构建了地衣芽孢杆菌基于代谢网络的动力学模型,对生物转化过程的动态行为进行了模拟;通过地衣芽孢杆菌bgl C和bgl H基因敲除菌株与野生型之间的代谢通量的差异分析,研究了地衣芽孢杆菌产纤维素酶的代谢机理,为进一步提高薯渣与汁水的转化效率提供理论依据和技术参数。地衣芽孢杆菌发酵薯渣与汁水工艺的改进。单独使用地衣芽孢杆菌发酵时,纤维素降解率仅有46.1%。因此建立了先用黑曲霉(Aspergillus niger)H3菌株发酵降解纤维素,再用地衣芽孢杆菌发酵生产细胞蛋白的两步法发酵工艺。为了进一步提高薯渣与汁水的转化效率,利用响应面分析法,对地衣芽孢杆菌发酵过程中的发酵条件进行了优化。在发酵温度为32.8℃,p H为6.7,接种量为1.8%的条件下,发酵液上清蛋白减少量最多,达到0.93 g/L,产物中粗蛋白含量达到38%以上,纯蛋白含量达到24%以上,说明发酵产品具有较高的经济价值。利用末端限制性片段长度多态性的分析方法,对发酵过程中微生物群体动态进行了分析,结果表明芽孢杆菌在发酵过程中占优势地位并发挥主导作用。发酵8 h后,芽孢杆菌大量生长,并抑制了薯渣与汁水中土著菌的生长,而在发酵32 h后,芽孢杆菌数量开始减少,土著菌有所生长。地衣芽孢杆菌的中心碳代谢网络的代谢通量分析。通过改进13C代谢通量分析方法、去除质谱误差、检测胞外代谢物浓度及建立地衣芽孢杆菌代谢网络,利用13C标记实验进行了地衣芽孢杆菌的代谢通量分析。结果显示64.7%的葡萄糖生成了6磷酸果糖,26.7%的葡萄糖流向磷酸戊糖途径。回补途径的通量达到葡萄糖摄入通量的4倍以上,说明回补途径反应迅速。该途径中的丙酮酸和草酰乙酸是氨基酸合成的重要前体物质,氨基酸的合成对其需求量很大,该结果表明,地衣芽孢杆菌的代谢特点是能够高效利用碳源合成氨基酸和蛋白质,因此,该菌种利于发酵生产细胞蛋白。对?bgl C菌株和?bgl H菌株与野生型菌株的代谢通量进行了对比分析。通过基因工程手段,分别构建了bgl C和bgl H基因的敲除菌株?bgl C和?bgl H。对比?bgl C菌株和?bgl H菌株与野生型菌株的代谢通量,发现?bgl C和?bgl H菌株的磷酸戊糖途径通量明显增高,三羧酸循环加快,回补途径减慢,同时,氧气转变为ATP速度加快,说明代谢过程中呼吸作用加快,耗氧量增加,菌体代谢消耗更多的ATP。这些变化是由基因敲除引起的,敲除后不仅缺失了原来的基因,同时引入了一个抗性基因,可能会造成氨基酸的合成有一定变化。磷酸戊糖途径通量增高产生大量的NDAPH,为体内合成反应提供充足的还原力。因此,磷酸戊糖途径和三羧酸循环是地衣芽孢杆菌纤维素酶代谢的关键转换点。限制磷酸戊糖途径和三羧酸循环,从而提高回补反应通量是提高地衣芽孢杆菌产纤维素酶的有效方法。

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