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PolyI:C复合物在体内外对非小细胞肺癌的抗肿瘤作用及其机制

【摘要】:非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)是癌症患者死亡的主要原因。现认识到免疫系统具有通过其先天和适应性免疫应答破坏癌细胞并抑制癌细胞生长的潜力,改变了 NSCLC治疗的前景。Toll样受体(toll like receptor,TLR),作为先天免疫中最重要的跨膜受体,参与诱导和调节免疫反应。TLRs存在于各种肿瘤细胞中,与癌症的发生和发展密切相关。一些类型的TLRs检测肿瘤抗原并引起原发性抗肿瘤免疫反应。TLRs可通过消除肿瘤抗原进一步阻止炎症性肿瘤微环境的形成。TLR3位于内体膜中,利用MyD88非依赖途径,募集TRIF激活激活蛋白1(active protain 1,AP-1),NF-κB 和干扰素调节因子(interferonregulatoryfactor,IRF)。作为 TLR3 的配体,PolyI:C 激活 TLR3,PKR,维甲酸诱导基因 1(retinoic acid-inducible gene-I,RIG-1)和黑色素瘤分化相关蛋白 5(melanoma differentiation-associated protein 5,MDA5),直接诱导癌细胞凋亡并破坏肿瘤微环境。此外,PolyI:C通过影响树突状细胞(dendritic cell,DC)成熟和I型干扰素(interferon,IFN)增强肿瘤抗原的免疫原性。这些证据表明TLR3可用作肺癌免疫治疗中的治疗靶标。磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B(phosphatidylinositol 3-kinase/protein kinase B,PI3K/Akt)在调节细胞增殖,抑制细胞凋亡,促进转移以及与癌症预后不良相关中起重要作用。因此,阻断Akt信号传导途径已成为抗癌疗法的目标。并且p53被称为Akt下游的肿瘤抑制基因。目前对p53和TLR的新见解表明p53调节癌细胞中的TLR信号传导,抑制癌细胞的增殖。最近的一项研究表明,PolyI:C可通过PI3K/Akt信号通路引起前列腺癌细胞凋亡。然而,关于PolyI:C影响NSCLC中PI3K/Akt/p53途径的信号蛋白的能力的信息很少。因此,我们假设TLR3激动剂PolyI:C可能干扰肺癌中的PI3K/Akt/p53信号传导。本研究通过在体外和荷瘤小鼠中使用LL/2和A549细胞研究了 PolyI:C的抗肿瘤作用,并探讨了其机制是否与干扰Akt磷酸化有关。第一部分PolyI:C复合物对LL/2及A549细胞株的抑制作用目的:探讨PolyI:C复合物在体外是否抑制小鼠LL/2及人A549细胞株的细胞增殖及细胞运动。方法:RT-QPCR法明确PolyI:C复合物干预LL/2及A549细胞前后TLR3 mRNA的表达。经细胞活力-毒性实验确认不同浓度的PolyI:C复合物对LL/2及A549细胞增值率的影响;单层细胞增殖实验检测PolyI:C复合物对LL/2及A549细胞倍增时间的影响;Annexin V-FITC/PI双染法测得PolyI:C复合物对LL/2及A549细胞的凋亡的影响;经流式细胞术确认PolyI:C复合物对LL/2及A549细胞细胞周期的阻滞。划痕实验评价PolyI:C复合物干预前后LL/2及A549细胞的愈合能力;transwell迁移实验考察PolyI:C复合物干预前后LL/2及A549细胞的纵向运动能力;transwell侵袭实验考察PolyI:C复合物干预前后LL/2及A549细胞的侵袭潜能。结果:正常情况下LL/2及A549细胞表达TLR3 mRNA,当给予PolyI:C复合物干预时TLR3 mRNA的表达明显升高(P0.001;P0.01)。给予浓度为10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL 浓度的 PolyI:C 复合物干预 LL/2 时,24h 时 LL/2细胞增殖率从94%降为76%,48h时细胞增殖率从48%降为32%;干预A549细胞时,24h时细胞增殖率从92%降为61%,48h时细胞增殖率从55%降为37%(P0.05)。经PolyI:C复合物刺激24h时LL/2细胞单层增殖率减少1.46倍,48h时减少2.87倍(P0.01;P0.001);刺激24h时A549细胞单层增殖率减少1.49倍,48h时减少2.07倍(P0.01)。给予PolyI:C复合物48h时测得LL/2细胞晚期凋亡率为(11.43±0.46)%(P0.001);48h时测得A549细胞晚期凋亡率为(20.14±0.85)%(P0.001)。PolyI:C 复合物干预 48h 时阻滞 LL/2 及 A549 细胞的 G1 期,百分比显著升高至(32.01 ±0.09)%及(55.16±0.97)%(P0.001)。PolyI:C复合物可抑制非小细胞肺癌细胞的平行运动能力,刺激LL/2细胞24h及48h 时的划痕间隙面积为(12.19±0.72)×105μm2、(9.03±0.73)× 105μm2,具有统计学差异(P0.05;P0.0l)。刺激A549细胞24h及48h时的划痕间隙面积为(7.50±0.98)X 105μm2、(5.25±0.71)× 105μm2,具有统计学差异(P0.01)。PolyI:C复合物在一定程度上可有效抑制两种细胞的垂直迁移能力及侵袭潜能(P0.01)。结论:1.PolyI:C复合物上调LL/2及A549细胞中TLR3 mRNA的表达。2.PolyI:C复合物在体外通过促进细胞凋亡,抑制细胞增殖,在LL/2及A549细胞中实现抗肿瘤作用。3.PolyI:C复合物在体外通过干扰LL/2及A549细胞的平行运动能力、纵向运动能力及侵袭潜能实现抗转移作用。第二部分PolyI:C复合物对小鼠NSCLC移植瘤的抑制作用目的:探讨PolyI:C复合物在小鼠体内抗肿瘤及抗转移功能。方法:选取小鼠肺腺癌细胞LL/2细胞株。将64只雌性C57BL/6小鼠随机分为4组,每组16只,在小鼠右前肢腋下接种LL/2细胞悬液,建立肺腺癌皮下移植瘤模型。当平均移植瘤体积达100mm3时,滴鼻组:0.3mg/只,间隔1天滴鼻给药一次;肌注组:0.3mg/只,间隔1天肌注给药一次;PBS组:100 μL/只,间隔1天给PBS一次;PD1组:100μg/只,1周1次腹腔注射。每隔一日测量肿瘤体积及小鼠体重,当平均移植瘤体积达2500mm3时每组处死小鼠6只,剥离肿瘤、肺、肝、脑组织,称取肿瘤质量,计算抑瘤率,其余继续给予相应药物治疗并绘制生存曲线。TUNEL法检测肿瘤组织内凋亡及坏死。HE染色观察各脏器转移情况。结果:肺癌移植瘤模型中,第7天四组移植瘤体积比较,差异无统计学意义(P0.05);肌注组第9、11、13、15、17、19、21天移植瘤体积较PBS组明显下降(P0.001);肌注组第11、13、15、17、19、21天移植瘤体积较PD1组明显下降(P0.05);滴鼻组第11、13、15、17、19、21天移植瘤体积较PBS组明显下降(P0.01);滴鼻组与PD1组移植瘤体积相比较,差异无统计学意义(P0.05)。PBS组、滴鼻组、肌注组、PD1组的肿瘤质量分别为(5.35±0.93)、(3.28±0.57)、(2.65±0.47)、(4.55±0.87)g,与 PBS 组相比较,滴鼻组 P0.01,肌注组P0.001;与PD1组相比较,滴鼻组P0.05,肌注组P0.01。滴鼻组、肌注组、PD1组抑瘤率分别为38.33%、50.39%、15.17%,滴鼻组及肌注组抑瘤率较PD1组明显升高(P0.001);肌注组抑瘤率高于滴鼻组(P0.01)。监测小鼠体重显示,滴鼻组小鼠体重减轻不明显(P0.05),第7次给药开始,肌注组小鼠体重明显下降,有统计学意义(P0.05)。PolyI:C复合物肌注组和滴鼻组中位存活期延长至44天和31天,而PBS组为25天,PD1组延长至42天。TUNEL凋亡试剂盒检测得出放大200倍时滴鼻组、肌注组、PD1组均发现较多的褐色细胞,在肌注组较滴鼻组及PD1组多见。肺组织HE染色得出PBS组中存在巨大的肿瘤转移灶,PolyI:C复合物滴鼻组和PD1组中存在较小的肿瘤转移结节,肌注组未发现肺转移但发现肿瘤形成前体。所有组肺部水肿,转移灶周围毛细血管增生,肺泡间隔增厚及肺泡结构破坏均严重。肝组织HE染色看出,除肌注组外,所有组均存在小结节性肝转移,PD1组肝转移小于对照组及滴鼻组,滴鼻组小于对照组。四组脑组织HE染色均未发现转移情况。结论:1.PolyI:C复合物在荷瘤小鼠中具有明显抗肿瘤作用。2.PolyI:C复合物在荷瘤小鼠中具有明显抗转移作用。3.PolyI:C复合物的副反应为体重下降。4.PolyI:C复合物可显著延长荷瘤小鼠的中位生存期。第三部分PolyI:C复合物在非小细胞肺癌中抗肿瘤机制的研究目的:探讨PolyI:C复合物在体内外对细胞因子及脾组织DC细胞群及PI3K/Akt/p53通路的影响。方法:将雌性C57BL/6小鼠随机分为2组,每组3只,对照组肌肉注射PBS 100μL/只,给药组肌肉注射PollyI:C复合物100 μL/只,2h后眼眶取血分离血清。经多重免疫分析法检测血清中炎性细胞因子的含量。选取小鼠肺腺癌细胞LL/2细胞株。将24只雌性C57BL/6小鼠随机分为4组,每组6只,在小鼠右前肢腋下接种LL/2细胞悬液,建立肺腺癌皮下移植瘤模型。当平均移植瘤体积达l00mm3时,滴鼻组:0.3mg/只,间隔1天滴鼻给药一次;肌注组:0.3mg/只,间隔1天肌注给药一次;PBS组:100μL/只,间隔1天给PBS一次;PD1组:100μg/只,1周1次腹腔注射。当平均移植瘤体积达2500mm3时处死小鼠取肿瘤、脾脏组织。用流式细胞术测得脾脏DC细胞群CDllc、CD80、CD86含量。用免疫组化法检测Akt及其下游通道蛋白p53、p21、cyclinDl、caspase3的表达。选取LL/2及A549细胞株,给予PolyI:C复合物干预48h,经western blot法检测给药前后Akt及其下游通道蛋白p53、p21、cyclinD1、caspase3的表达情况。结果:健康小鼠肌注PolyI:C复合物2h后IL-2、IL-4、IL-6、TNF-α分泌量为(30.81±11.34)、(3.62±1.02)、(1010.84±162.09)、(301.33±19.16)pg/mL,较 PBS组明显升高(P0.01、P0.05、P0.001、P0.001)。经流式细胞术测得荷瘤小鼠PolyI:C复合物组脾组织CDllc阳性率为7.85%,CD80阳性率及荧光强度为20.16%和1210.76,CD86阳性率及荧光强度为4.01%和353.20,均较对照组明显升高(P0.01;P0.01;P0.01;P0.001)。免疫印迹结果显示PolyI:C复合物对LL/2和A549细胞中p-Akt、CyclinD1的活性产生有效的抑制作用(P0.01;P0.001),对p53、p21、cleaved caspase3的表达产生有效的刺激作用(P0.001)。用药前后对LL/2和A549细胞的Aktl/2的刺激无明显差异(P0.05)。caspase3的表达在LL/2细胞中药物干预升高(P0.05),A549中无明显差异(P0.05)。免疫组化法检测肿瘤组织中的蛋白表达,PolyI:C复合物肌注组中p53、p21、caspase3的表达较PBS组升高,而对p-Akt、cyclinDl表达较对照组下降。结论:1.PolyI:C复合物刺激上调正常小鼠血清炎性细胞因子的分泌。2.PolyI:C复合物刺激通过上调荷瘤小鼠脾脏组织DC细胞群CD80、CD86分子发挥抗肿瘤作用。3.PolyI:C复合物在体内外经PI3K/Akt/p53通路下调p-Akt、cyclinD1影响细胞周期,上调p53、p21、caspase3诱导NSCLC细胞凋亡,进而抑制细胞增殖,发挥抗肿瘤作用。

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