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骨髓间充质干细胞向视网膜样结构诱导分化的体外和体内研究

【摘要】:视神经萎缩是世界范围内造成不可逆性盲目的主要原因之一。而导致视网膜神经节细胞损伤的青光眼、造成视网膜神经上皮层损害缺血性视网膜视神经病变如:糖尿病性视网膜病变和高血压性视网膜病变等是导致视神经萎缩的主要眼病。对于视网膜神经上皮层已严重受损的疾病,目前的治疗办法局限于视神经保护上,但这种办法不足以长期保存患者的有用视力。国内外学者为此应用多种办法制作眼缺血再灌注的动物模型。采用的治疗策略包括输注生长因子或细胞因子以减缓视网膜细胞的调亡、移植视网膜神经节细胞以重建视网膜的神经网络等。干细胞生物学的快速发展又为视网膜损伤治疗开辟了一条新的途径。用于眼内移植的干细胞包括胚胎干细胞、胚胎视网膜干细胞、成体视网膜干细胞、神经干细胞等。近几年骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs)由于其具有多向分化潜能,可以取材于患者自体骨髓,移植排斥反应弱而成为干细胞研究的热点。尤其是BMMSCs向神经细胞诱导分化的研究倍受重视。视网膜组织被认为是神经系统的延续,而国内外关于BMMSCs向视网膜样细胞和结构诱导分化的研究很少。 本研究联合应用贴壁筛选法和密度梯度离心法分离纯化骨髓间充质干细胞,采用流式细胞仪、免疫细胞化学法进行鉴定,并且将骨髓间充质干细胞注入Balb/c裸鼠皮下初步证明了骨髓间充质干细胞的多向分化潜能。在体外实验中,分别应 WP=89 用化学诱导剂、神经生长因子、大脑皮层神经细胞条件分化液、视网膜细胞条件分化液诱导传至第六代的骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。最后以视网膜细胞条件分化液为诱导条件详细观察了不同时间骨髓间充质干细胞转化为神经元样细胞形态、数目的变化。在体内实验中,将骨髓间充质干细胞移植于裸鼠的视网膜下间隙和玻璃体腔初步证明骨髓间充质干细胞在眼内可分化视网膜样结构。并且将BMMSCs移植于大鼠缺血再灌注眼内,利用BrdU标记技术与荧光免疫组织化学方法相结合,示踪了BMMSCs在视网膜下的变化过程,观察BMMSCs在眼内的生长、分化和迁移情况。 结果证明:体外分离纯化的BMMSCs细胞膜抗原CD29、CD44有阳性表达, CD34、CD45在所培养的细胞表面却呈阴性表达,细胞基质中胶原蛋白Ⅱ没有表达。酶细胞化学法检测培养细胞ALPase为阴性。透射电镜下显示培养的细胞胞质内有大量的核糖体、线粒体和粗面内质网,。以上实验鉴定证实我们所培养的细胞不是造血干细胞、成纤维细胞、成骨细胞、软骨细胞,是处于未分化阶段的间充质干细胞。我们将传代培养的大鼠骨髓BMMSCs注入裸鼠皮下,经过1个月的生长,在注射局部出现了由BMMSCs分化形成的多种组织类型:骨、软骨、脂肪、骨骼肌及肌腱样组织等结构。证明扩增后BMMSCs的多向分化潜能尚未丢失。体外不同的神经分化条件诱导BMMSCs分化后NSE、NF-M的阳性率都较高,GFAP呈弱阳性。各组诱导条件诱导BMMSCs表达NSE的阳性率统计学分析无显著性差异。经视网膜神经细胞条件分化液诱导,部分细胞表达神经节细胞特异性标志Thy1.1。BMMSCs裸鼠眼内移植,进一步发现BMMSCs在玻璃体腔内和视网膜下间隙生长,并且分化出现一些小圆形细胞形似视网膜外核层细胞,尚见到细胞聚积成多层排列,与视网膜的视细胞层排列相似,但形态欠圆,核较大,染色质较粗,这些形态学改变提示BMMSCs可能已开始向视网膜组织中的一些成分分化。基于 WP=90 BMMSCs在体外适宜条件下可诱导为神经样细胞和视网膜样细胞,将BMMSCs移植于大鼠缺血再灌注眼内。 HE染色表明缺血再灌注损伤后主要损伤的是视网膜神经节细胞层和内核层。利用BrdU标记技术与荧光免疫组织化学方法相结合,示踪了BMMSCs在视网膜下的变化过程,发现BMMSCs逐渐由移植区域向视网膜内层迁移,并且在视网膜受损伤最严重的神经节细胞层定居、连接成片。为了检测BMMSCs能否在损伤大鼠视网膜下形成具有神经细胞特性的视网膜样结构,我们做了BrdU阳性细胞连续切片的免疫组化染色,结果显示在新形成的视网膜组织中表达了神经细胞的表型蛋白。本实验将BMMSCs成功移植于缺血再灌注损伤眼视网膜下并与视网膜整合可为今后神经再生以及进一步治疗视神经性疾病的研究奠定基础。

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