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利用CRISPR-Cas12a系统检测非洲猪瘟病毒的研究

【摘要】:近年来,非洲猪瘟(African swine fever,ASF)在全球肆虐,对养殖业造成了巨大的威胁。在没有商用疫苗的情况下,快速可靠的实验室诊断对于疾病的预防和控制至关重要。传统的非洲猪瘟检测方法具有操作复杂、需专业技术人员等不足,难以满足非洲猪瘟高效检测的需求。目前,新兴的基因编辑工具CRISPR-Cas12a已被应用于核酸检测,该检测比qPCR和ELISA更快速、易实施。基于Cas12a在切割靶标DNA后可切割ssDNA的活性,结合等温扩增系统,加入一端修饰荧光基团一端修饰猝灭集团的ssDNA报告系统,可检测痕量DNA。本研究建立了一种改良的Cas12a检测DNA的方法,并应用于ASFV DNA的检测。(1)CRISPR-Cas12a蛋白表达纯化及检测ASFV DNA方法建立。本实验基于重组表达载体Cas12a-pet-28a,诱导表达纯化Cas12a蛋白,并利用western blot进一步验证了目的蛋白。基于ASFV保守区p54,选择了3个位点作为ASFV检测位点,Cas12a对1ASFV、2ASFV和3ASFV位点进行检测,实验证明Cas12a蛋白能特异性识别这三个靶标DNA位点,并切割ssDNA报告系统tzCas12a-j,与对照组产生荧光差,即Cas12a蛋白能有效检测这三个位点,成功建立Cas12a检测ASFV DNA方法。(2)CRISPR-Cas12a检测DNA方法优化。由于1ASFV的实验组荧光信号(322010±39442 a.u.)显著高于2ASFV组(206115±29239 a.u.)和3ASFV组(159120±12190 a.u.)。因此,本实验选择了1ASFV位点对检测体系的温度、pH、ssDNA报告系统和反应缓冲液组分进行了优化,并发现ssDNA报告系统tzCas12a-j、反应温度37°C、pH 8.0且含有Mg~(2+)5 mM、1mM DTT、5%的甘油和50μg/mL肝素的反应体系为Cas12a检测ASFV DNA最佳条件。(3)CRISPR-Cas12a对ASFV检测的特异性和灵敏性评估。基于1ASFV位点的不同浓度梯度靶标DNA检测结果显示,检测极限至10~(-18)M。利用1ASFV完全匹配的crRNA检测伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV2),研究表明,tzCas12a-j不能被切开,几乎不会释放荧光,证明检测具有良好的特异性,与PRV和PCV2无交叉检测。综上所述,本研究成功建立了一种基于Cas12a检测ASFV DNA的高灵敏性和高特异性的检测方法。该方法为非洲猪瘟的快速检测提供了新的思路,并将Cas12a推广至快速检测病原微生物领域。

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