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结核分枝杆菌H37Rv感染THP-1源性巨噬细胞基因调控网络的构建与分析

【摘要】:背景及目的:2016年全球约170万人死于结核病(Tuberculosis,TB),超过因感染人类免疫缺陷病毒(HIV)而死亡的病人人数,结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,M.tb)作为TB的病原体,再次成为了导致全球人类死亡的主要传染病因素。近年来,由于耐药结核分枝杆菌甚至多重耐药结核分枝杆菌的出现和快速传播,加之目前卡介苗(BCG)疫苗的保护力有限,使得TB疫情很难得到有效控制。基因芯片技术可以同时检测上千万个基因的表达,绘制全基因组表达谱,这一技术的产生拓展了生物学的研究方法,极大地推动了基因功能的阐明以及基因间相互作用的研究。本研究基于结核分枝杆菌H37Rv感染人急性白血病单核细胞(Human acute monocytic leukemia cell line,THP-1)源性巨噬细胞表达谱芯片,运用生物信息学的分析方法,构建H37Rv感染THP-1源性巨噬细胞基因调控网络,挖掘出与结核分枝杆菌感染过程相关的功能模块,并筛选出关键基因,对深入了解结核病的发病及宿主防御机制具有重要意义,并为更有效地诊断与治疗结核病提供了新视角。材料及方法:从NCBI的GEO Datasets数据库中获取结核分枝杆菌H37Rv感染人白血病单核细胞THP-1源性巨噬细胞模型的芯片数据集,使用R语言的limma包筛选出差异表达的基因,运用DAVID(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery)对差异基因进行功能注释分析(GO-Analysis)和信号通路富集分析(Pathway-Analysis),再整合转录调控元件数据库(Transcriptional Regulatory Element Database,TRED)分析差异表达的转录因子与基因的靶向关系,构建结核分枝杆菌H37Rv感染THP-1源性巨噬细胞转录因子-基因调控网络,进一步运用DAVID对网络调控图中的基因和转录因子(Transcription Factor,TF)进行功能注释分析以及疾病关联分析。进一步构建结核分枝杆菌H37Rv感染THP-1源性巨噬细胞的细胞实验模型,借助形态学分析方法、激光共聚焦显微镜和ELISA方法等验证模型构建成功与否,并通过qRT-PCR验证网络中重要节点基因(CYP19A1)和转录因子(NFKB1,STAT1,PPARG,CEBPB)的表达水平,最后对基因NFKB1,CEBPB和CYP19A1进行受试者工作特征曲线(ROC曲线,receiver operator characteristic curve)分析,确定其区分感染细胞与未感染细胞的特异性与灵敏度。实验结果:本研究收集到2个基因表达谱原始数据集,利用limma包筛选获得625个差异表达基因,其中427个基因表达上调,198个基因表达下调。对差异表达基因进行GO分析,得到在生物过程(Biologocal Process,BP)、细胞组分(Cellular Component,CC)和分子功能(Molecular Function,MF)分类中的基因条目分别为179、61和85条,如defense response to virus,response to virus,inflammatory response(BP);cytosol,cytoplasm,nucleoplasm(CC);chemokine activity,protein binding,ATP binding(MF)等。Pathway分析发现差异基因主要富集在Influenza A,Herpes simplex infection,NF-kappa B signaling pathway等47个条目。根据差异表达的8个转录因子(NFKB1,STAT1,PPARG,CEBPB,E2F2,STAT4,RELB,NFKB2),整合TRED数据库,建立了包含58个差异基因的转录因子-基因调控网络,其中转录因子NFKB1,STAT1,CEBPB和PPARG调控了大部分差异表达基因,网络中同时受三个以上转录因子调控的基因称为枢纽基因(Hub Gene),包括CYP19A1,IL6和IRF1,其中CYP19A1是被多个转录因子调控的基因。进一步分析网络中58个基因主要注释在inflammatory response、immune response、extracellular space、cytosol、protein binding、transcription factor activity,sequence-specific DNA binding等功能上,并与cancer、infection、immune、renal和reproduction等疾病相关。生物学验证方面,我们成功建立了结核分枝杆菌H37Rv感染THP-1源性巨噬细胞的细胞实验模型,使用qRT-PCR技术检测网络中重要节点基因(CYP19A1)和转录因子(NFKB1,STAT1,PPARG,CEBPB)的表达水平,结果发现,除转录因子STAT1外,基因CYP19A1和转录因子NFKB1,PPARG,CEBPB均上调表达,与从芯片数据分析出的基因表达趋势结果相一致,感染组中基因CYP19A1和转录因子NFKB1,CEBPB的表达与对照组相比有显著差异,具有统计学意义。ROC曲线分析NFKB1,CEBPB和CYP19A1发现曲线下面积(AUC)分别为0.832、0.816和0.710,表明基因能够较好区分感染与未感染细胞。结论:(1)构建了以NFKB1,STAT1,PPARG和CEBPB为主要转录因子的TF-mRNA基因调控网络,呈现出巨噬细胞免疫应答结核分枝杆菌感染过程中基因间相互作用及调控关系。(2)成功建立了结核分枝杆菌H37Rv感染THP-1源性巨噬细胞的细胞实验模型。(3)报道基因CYP19A1在巨噬细胞免疫应答结核分枝杆菌感染过程中的上调表达及其在负调控巨噬细胞趋化的潜在功能,为研究巨噬细胞-结核分枝杆菌相互作用影响提供新的线索。

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