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生物钟基因Npas2在乳腺癌发生中的作用及刺五加黄酮对生物钟基因表达的影响和抗肿瘤机制

【摘要】:(1)生物钟基因Npas2在人乳腺癌中的表达及其临床意义 目的:研究生物钟基因Npas2在乳腺癌中的表达,探讨其与乳腺癌发生、发展的关系。 方法:应用免疫组织化学技术分析30例乳腺浸润癌、20例瘤旁正常乳腺组织、20例乳腺癌前病变(小叶原位癌10例和乳管内乳头状瘤10例)和20例乳腺纤维瘤中Npas2的表达情况。其中对10例乳腺小叶原位癌和30例乳腺浸润癌按国际抗癌联盟(UICC)分期标准进行分期,其中T0期10例,I期9例、II期16例和III期5例;有淋巴结转移者11例,无淋巴结转移者19例。采用Motic Images Advanced3.2图像分析仪,在200倍镜下连续观察5个视野检测,测量灰度值,以灰度值表示Npas2蛋白阳性表达的高低,灰度值越小,说明Npas2蛋白阳性表达越高;灰度值越大,说明Npas2蛋白阳性表达越低。 结果:Npas2蛋白在正常乳腺组织、乳腺癌前病变和浸润癌中均有表达,特异性着色位于细胞浆内,呈棕色颗粒。Npas2蛋白在正常乳腺组织中呈阳性表达,其灰度值为(114.3±2.31),在浸润癌中表达明显降低,呈淡黄色或着色较浅,其灰度值(159.5±6.79),两组比较差异有显著性意义。在乳腺癌前病变中呈阳性表达,其抗体灰度值为(132.3±2.11),在乳腺纤维瘤中Npas2表达明显减弱或不表达,其灰度值(206.3±3.02);在I期、II期和III期乳腺浸润癌中Npas2的表达依次降低,其抗体灰度值分别为(142.3±2.46),(161.2±4.22)和(176.3±2.93)。与T0期和I期乳腺癌比较,在II期和III期乳腺癌中Npas2表达明显减弱,差异有统计学意义(P0.05)。在乳腺浸润癌中,无淋巴结转移组和有淋巴结转移组Npas2表达的灰度值分别为(156.8±3.23)和(166.3±4.04),两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。考虑可能纳入的样本数不够有关。 结论:Npas2在乳腺癌中表达明显下调,与乳腺癌的发生、病理和临床分期关系密切。Npas2低表达与肿瘤瘤体大小、浸润深度有关,Npas2高表达可能是在乳腺癌发展中具有保护性作用。在乳腺癌癌前病变中Npas2表达增强,提示其可能在阻止癌前病变恶变中发挥作用。Npas2功能降低可能是乳腺癌发生的一个重要因素。 (2)刺五加黄酮对MCF-7细胞系中Npas2和Per2表达的影响和抗肿瘤机制 目的:通过检测刺五加黄酮对MCF-7细胞中Npas2和Per2的表达和对MCF-7细胞生长抑制作用以及对细胞增殖、凋亡相关蛋白表达和基因组稳定性的影响,探讨刺五加黄酮调节昼夜节律和抗肿瘤的机制。 方法:采用MTT法检测不同浓度的刺五加黄酮对MCF-7细胞生长抑制作用;应用流式细胞仪检测刺五加黄酮对MCF-7细胞周期的影响;采用实时定量PCR的方法检测不同浓度的刺五加黄酮作用MCF-7细胞,不同时间点细胞周期相关蛋白Cyclin D1和P21转录的影响;应用免疫荧光染色方法检测刺五加黄酮对MCF-7细胞生物钟基因Npas2和Per2表达的影响,采用软件定量Npas2和Per2的荧光表达强度。采用Tunel细胞凋亡检测方法观察不同浓度的刺五加黄酮对MCF-7细胞凋亡的诱导作用,细胞凋亡指数评估采用同一视野中凋亡阳性细胞的百分率显示。采用免疫荧光法检测刺五加黄酮对MCF-7细胞Bax、Bcl-2和c-myc等凋亡相关蛋白表达水平的影响。采用实时定量PCR法观察Brg1转录水平的变化和采用免疫荧光法检测对Brg1蛋白表达的影响。采用Western Blotting方法检测刺五加黄酮作用MCF-7细胞,在6h、12h和24h时间点的总pRb和磷酸化pRb蛋白的表达变化。图像分析扫描蛋白条带灰度,以细胞内总pRb蛋白-磷酸化pRb蛋白灰度为去磷酸化pRb表达量,以ppRb/pRb和(pRb-ppRb)/pRb进行半定量分析。 结果:浓度为100μmol/L的刺五加黄酮可使MCF-7细胞中Npas2和Per2表达强度明显增加(p0.01),能抑制MCF-7细胞在体外的增殖,且抑制作用有明显的剂量和时间依赖性。作用24h后在浓度低于75μmol/L时对MCF-7细胞生长没有抑制作用,甚至其抑制细胞生长作用反而下降,出现促进细胞增殖的现象;作用48h后抑制MCF-7细胞生长的浓度提前到75μmol/L。浓度为100μmol/L的刺五加黄酮作用MCF-7细胞后,使G1期细胞增多,S细胞减少,G2/M期细胞减少,表明刺五加黄酮既可阻止细胞由G1期进入S期,也可阻止进入分裂期,抑制细胞有丝分裂,表明刺五加黄酮可能通过改变细胞周期来抑制肿瘤细胞生长。浓度为50μmol/L刺五加黄酮作用MCF-7细胞24h后Cyclin D1基因转录水平明显增高,100μmol/L刺五加黄酮作用后Cyclin D1基因转录水平明显增高,且时间提前到6h,12h下降到正常水平。P21基因转录水平与刺五加黄酮的浓度无关,早期6h时间点转录增强,12-24h表达水平下降。正常培养的MCF-7细胞,偶见细胞凋亡阳性细胞,浓度为50μmol/L刺五加黄酮作用后细胞凋亡指数为0.8%,100μmol/L后细胞凋亡指数增加为5.2%,200μmol/L后细胞凋亡指数为12.6%,结果表明浓度为200μmol/L刺五加黄酮能诱导MCF-7细胞发生凋亡(p0.01)。随着刺五加黄酮剂量增加,细胞凋亡指数也增加。浓度为100μmol/L的刺五加黄酮作用后,采用软件定量荧光表达强度显示Bax表达强度明显增加(p0.01),Bcl-2表达强度明显减弱(p0.01),c-myc蛋白表达强度明显减弱,Bax/Bcl-2比值明显增加。浓度为50和100μmol/L刺五加黄酮使Brg1基因转录6h有增高的趋势,12h时达峰值(p0.01),24h降至正常水平以下。100μmol/L的刺五加黄酮作用MCF-7细胞12h和24h后磷酸化pRb蛋白表达下降,去磷酸化的pRb蛋白增加,有明显统计学差异(p0.05)。 结论:1.浓度为100μmol/L的刺五加黄酮可使MCF-7细胞Npas2和Per2蛋白表达增强,Npas2和Per2蛋白表达增强可能是刺五加黄酮调整昼夜节律和抗肿瘤的机制;2.浓度为150μmol/L的刺五加黄酮在体外抑制MCF-7细胞增殖,通过改变细胞周期和调控细胞周期蛋白Cyclin D1和P21的表达抑制肿瘤细胞的增殖;3.浓度为200μmol/L刺五加黄酮可诱导细胞凋亡,通过下调抑制凋亡基因Bcl-2及上调促凋亡基因Bax的表达来诱导细胞凋亡,进而发挥抗肿瘤的作用;4.浓度100μmol/L刺五加黄酮可促进MCF-7细胞Brg1、Npas2和Per2等基因的表达,提示生物钟基因Npas2和Per2及抑癌基因Brg1可能在乳腺癌发生中发挥作用。浓度为100μmol/L刺五加黄酮使MCF-7细胞pRB处于低磷酸化状态,调控细胞周期调控点使细胞周期停滞,使细胞有时间进行修复,维持DNA稳定,提示刺五加黄酮可能在维持基因组稳定性中发挥作用。

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