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拮抗菌地衣芽孢杆菌L_1的分离、培养及应用初探

【摘要】:蔬菜和水果中富含Vc和无机盐,营养价值很高,但是它们在采后容易受到病害的侵染,以至腐烂变质。目前,化学防治是抑制蔬菜和水果采后病害的重要途径,但是由于一些化学药剂具有毒副作用,且污染环境,其在果蔬中的残留量及其毒副作用一直是人们关心的问题,因此,寻找新的安全的控制采后腐烂的方法是当前果蔬贮藏研究中的一个热点;饲用益生菌的应用效果主要取决于两个方面:菌株的有效性和可存活的菌体数量。筛选高效的菌株是一项前期的基础性工作,不断寻求新的有益菌株,构建庞大的饲用益生菌资源库,使之造福于我国畜牧行业具有深远的意义。正是基于上述考虑,本试验首先从自然菌落中筛选出高效拮抗菌株,并对其性质和培养条件进行考察,为其用于果蔬防腐保鲜工业和饲料添加剂工业中提供科学依据。 首先采用体外筛选培养法,共筛选出5株拮抗活性较强的菌株,根据革兰氏染色观察菌体形态和菌落特征、16项生理生化鉴定试验的结果,参考芽孢杆菌鉴定表,可初步确定L1为地衣芽孢杆菌,L2、L4、L5为腊样芽孢杆菌,L3为短小芽孢杆菌。 测定了L1、L5、L3三株菌的拮抗图谱,采用琼脂扩散法考察了三株菌的抑菌效价、热稳定性、酸碱稳定性、蛋白酶K的稳定性等理化性质,结果表明:L1、L5的抗菌谱较广,其中L1的拮抗能力最强。L1菌发酵滤液对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌的抑菌效价分别为2000IU/mL、1500 IU/mL、1500IU/mL。L1菌的热稳定性最强:在30℃时抑菌活性最大,37℃放置1h抑菌活性只降低6%;60℃放置1h,抑菌活性下降了29%;100℃放置30min抑菌活性下降45%,放置1h,抑菌活性下降48%;121℃放置30min,抑菌活性下降55%,放置1h,只保持40%的抑菌活性;L3菌发酵滤液的热稳定性最差:121℃放置1h,基本无抑菌活性。L1菌的发酵滤液的酸碱稳定性最强:在pH=7.0达到最大抑菌活性,在pH=3.0时能够保持71%左右的抑菌活性,在pH=11.0时抑菌活性已经降低了33%;L3菌发酵滤液的酸碱稳定性最差:在pH=11.0时只保持30%的抑菌活性。L1、L5、L3菌株发酵去菌液中加入蛋白酶K后,去菌液的抑菌活性都会不同程度的增强,其中L1菌株的抑菌活性增加的最多。 同时对菌株L1的去菌培养液用硫酸铵沉淀法,获得抗菌蛋白晶体。利用对照培养法,得出了该菌株的抑菌机理为:拮抗菌地衣芽孢杆菌L1能够强烈抑制病原菌的生长。 考察了两株菌L1和L5的协同增效性,结果表明:两株菌的培养液混合后,对指示菌种的拮抗作用增强,且按3:1的比例将培养液混合后,所得的抑菌圈直径最大,混合后最大效价可提高96%;将两株菌的培养去菌液混合后,对指示菌种的拮抗作用也增强,并且以3:1的比例混合后所得的抑菌圈直径最大,混合后最大效价可提高89.1%。 为了实现地衣芽孢杆菌L1的工业化生产,对该菌株的生长条件、液态培养条件进行了研究,对其固态培养条件进行了初步研究,同时对其在实际中的应用进行了初步探讨。 首先对地衣芽孢杆菌L1的最适生长条件进行考察,得到的结果是:L1菌的最适生长温度为35℃;最适生长培养基为:胰蛋白胨1.0%、酵母浸出粉0.5%、NaCl1.0%、水100%、赖氨酸0.05%;最适初始pH为7.0;摇瓶转速为150r/min;L1菌为好氧菌,所以在摇瓶培养时要尽量采用较小装量,本实验所采用的装量为50mL培养基装入500mL三角瓶中;L1菌的种龄为18~21h。 采用单因素实验法对地衣芽孢杆菌L1液体发酵的主要影响因子温度、转速、初始pH值等进行了考察,确定了最佳培养条件:温度为35℃、转速为180r/min、初始pH值为7.0;并通过正交实验对其发酵培养基在摇瓶中进行了优化,优化后的培养基为:葡萄糖5g、酵母浸膏2g、尿素3g、NaCl 10g、水1000mL。在优化条件下,发酵液中活菌数达到4.90×1010cfu/mL明显高于原发酵培养基结果5.10×109cfu/mL。 通过正交实验得出地衣芽孢杆菌L1较合适的固态培养基为:每千克固体物料含稻糠600g、麸皮400g、红糖6g、含水量为固体物料干重的60%。当采用液体种子接种,接种量为10%(V/W)时,培养48h的菌体浓度为7.15×1010CFU/g鲜曲,芽孢浓度为5. 75×1010CFU/g鲜曲,芽孢形成率在80%以上。 动物实验表明,地衣芽孢杆菌L1在提高饲料利用率、调节动物胃肠道菌群平衡、防止腹泻等方面具有明显的作用效果;水果防腐保鲜实验表明,用该菌株发酵液处理后的水果的保鲜期可以延长3~5天。

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