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壳聚糖对奶牛免疫功能的影响及其调节机理的研究

【摘要】:本论文共分五个部分研究和探讨了壳聚糖(CHI)对奶牛免疫功能的影响及其调控机制。试验1~3为体内法,将40头泌乳中期荷斯坦奶牛依照产奶量、泌乳期和胎次等相一致的原则,随机分为5个壳聚糖组,每个处理8个重复,每个重复1头。对照组饲喂基础日粮(没有添加壳聚糖),试验组日粮是在基础日粮中分别添加了500、1000、1500和2000 mg/kg壳聚糖配制而成。试验期为60天,分为前期(0-30天)和后期(30-60天)两个阶段,饲养期间奶牛自由采食和饮水。试验1研究了壳聚糖对奶牛免疫和抗氧化功能的影响,试验2和3分别从NO途径和花生四烯酸(AA)途径研究了壳聚糖影响奶牛免疫功能的调节机制。试验4利用体外法研究了低聚壳聚糖对LPS刺激的外周血淋巴细胞(PBLs)免疫活性的影响。试验采用2×5二因子设计,即2个LPS添加水平×5个低聚壳聚糖添加水平。共10个处理,每个处理6个重复。LPS添加水平分别为0和10μg/mL LPS,低聚壳聚糖添加水平分别为0、40、80、160和320μg/mL。试验5利用体外法研究了CHI对抑制剂存在下LPS刺激的PBLs免疫活性的影响。试验采用2×2×2三因子设计,即2个LPS添加水平×2个低聚壳聚糖添加水平×2个抑制剂添加水平。共8个处理,每个处理6个重复。其中,LPS添加水平分别为0和10μg/mL LPS,低聚壳聚糖添加水平分别为不0和160μg/mL低聚壳聚糖,抑制剂添加水平分别为不添加抑制剂和添加一定量的抑制剂。试验结果显示:(1)随奶牛日粮中壳聚糖添加水平的升高,试验后期血清中免疫球蛋白G(IgG)和白介素2(IL-2)浓度呈极显著二次曲线升高效应(P0.01),IgA浓度和过氧化氢酶(CAT)活性呈趋于显著二次曲线升高效应(0.05P0.1),IL-2浓度和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活性呈趋于显著一次线性升高效应(0.05P0.1);试验前期GSH-PX活性呈显著二次曲线升高效应(P0.05);此外,随壳聚糖添加水平的增加,整个试验期可溶性CD4(sCD4)和丙二醛(MDA)含量呈极显著的一次线性和二次曲线降低效应(P0.01)。表明日粮添加适宜剂量的壳聚糖可以改善奶牛的免疫和抗氧化功能,并且这种作用具有剂量依赖性。(2)随奶牛日粮中壳聚糖添加水平的升高,试验后期血清中一氧化氮(NO)含量呈极显著的一次线性(P0.01)和二次曲线升高效应(P0.01),诱导型一氧化氮合酶(iNOS)活性呈显著的二次曲线升高效应(P0.05)。随壳聚糖添加量的增加,iNOS和核转录因子-κB(NF-κB)基因表达量均表现为趋于显著的一次线性(0.05P0.1)和显著的二次曲线(P0.05)增加效应。并在1500 mg/kg壳聚糖添加组效果最明显。这表明壳聚糖可通过增加iNOS和NF-κB的基因表达量,增加iNOS的活性,进而促进机体内NO的生成,对奶牛免疫功能起到调节的作用,而且这种作用呈现剂量依赖效应。(3)随奶牛日粮中壳聚糖添加水平的升高,试验后期血清中花生四烯酸(AA)和白三烯B4(LTB4)浓度及脂氧化酶(5-LOX)活性呈显著的一次线性升高效应(P0.05);LTB4、前列腺素E2(PGE2)和胞浆型磷脂酶A2(cPLA2)浓度及环氧合酶(COX-2)活性分别呈极显著(P0.01)或显著的(P0.05)二次曲线升高效应;试验前期血清中cPLA2浓度呈显著的一次线性升高效应(P0.05);另外,随着壳聚糖添加量的升高,试验前期和后期cPLA2基因表达量均呈极显著的线性(P0.01)或二次曲线(P0.01)增加效应;5-LOX基因表达量呈显著的二次曲线增加效应(P0.05)。试验后期COX-2基因表达量呈显著的二次曲线增加效应(P0.05),并且在1500 mg/kg壳聚糖添加组表现为最佳。这表明壳聚糖可以通过增加cPLA2、COX-2和5-LOX基因表达,提高cPLA2、COX-2和5-LOX的活性,促进免疫细胞对PGE2、LTB4和AA的释放,进而影响奶牛的免疫功能,并且这种作用呈现剂量依赖效应。(4)在无LPS刺激的条件下,壳聚糖显著升高PBLs培养液中IL-1、IL-6、NO和AA的浓度、iNOS、cPLA2和COX-2的活性及iNOS、NF-κB、cPLA2和COX-2的基因表达量(P0.05)。在LPS的刺激下,添加壳聚糖显著降低IL-1、IL-2、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF-α)、NO和AA浓度、iNOS、COX-2和PGE2活性及NF-κB、cPLA2和COX-2的基因表达量(P0.05)。这提示壳聚糖既能通过NO和AA分子途径改善正常生理状态下机体的免疫功能,也能缓解或消除因LPS刺激引起的炎症因子的过度升高。(5)在LPS的刺激作用下,LPS可以显著增加NO浓度、iNOS活性和iNOS表达量(P0.05),在添加壳聚糖后显著降低了NO浓度和iNOS活性(P0.05),又在一氧化氮合酶抑制剂(1400W)或者NF-κB抑制剂(PDTC)存在下,添加壳聚糖对上述指标没有产生显著影响。表明壳聚糖引起的PBLs中NO浓度的升高,是通过提高iNOS活性来完成的。此外,在无LPS存在下,壳聚糖能够显著提高AA浓度(P0.05),在添加PLA2抑制剂(AACOCF3)后,壳聚糖对AA浓度没有产生显著影响。在有LPS的刺激作用下,LPS可以显著增加AA和PGE2浓度及cPLA2及COX-2活性(P0.05),添加壳聚糖后显著降低了AA和PGE2浓度及COX-2活性(P0.05),而在添加PLA2抑制剂(AACOCF3)后,壳聚糖对上述指标没有产生显著影响。这表明壳聚糖可以升高cPLA2和COX-2的酶活性,进而升高AA和PGE2浓度,来改善动物的免疫力。而且结果也提示壳聚糖对奶牛PBLs中NO和AA途径的相关指标具有双向调节作用。综上所述,壳聚糖可以影响奶牛的抗氧化和免疫功能,机体内的NO和AA分子通路是其调节免疫功能的机制。并且通过试验结果表明,壳聚糖在奶牛日粮中的适宜添加量为1500 mg/kg。

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