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阿拉善荒漠区珍稀泌盐植物长叶红砂响应盐胁迫的转录组学研究

【摘要】:长叶红砂(Reaumuria trigyna)是内蒙古东阿拉善-西鄂尔多斯地区特有的双子叶泌盐盐生小灌木,具有适应盐渍荒漠环境的独特形态特征和生理调控机制,是研究植物耐盐机理、获得耐盐优异基因的好材料。然而,由于遗传信息的缺乏,使得针对该植物耐盐分子机理的研究进展缓慢。本研究利用Illumina测序技术对正常生长(C21)和盐胁迫处理(T43)的长叶红砂进行转录组深度测序,获得了该植物大量的表达基因信息,分析了其响应盐胁迫的转录组水平变化,探讨了离子平衡调节及活性氧清除系统在该植物盐胁迫响应过程中发挥的作用;此外,尝试了利用DDRT-PCR (Differential Display Reverse Transcription PCR)技术从海量转录组数据中快速筛选盐胁迫诱导基因的方法,并在所得转录组数据中进行了SSR (Simple Sequence Repeat)位点的识别和初步验证。研究结果如下: 1.经测序,C21和T43样本分别得到约2651.3和2816.7万条测序读长(Read),总数据量超过5G,搭建了长叶红砂转录组信息平台;去除低质量读长后,两数据库中分别有92.65%和92.54%条读长错误出现率为1%(Q20),可用于后续转录组的从头(de novo)组装。 2.经de novo组装,两数据库的高质量读长分别被组装为68076(C21)和71194(T43)条Unigenes;对上述序列做进一步拼接和去冗余,最终得到65340条All-Unigenes;其中,35459(52.27%)条Unigenes与公共蛋白数据库中已报道的基因有较高同源性,13552条Unigenes被注释到44个GO (Gene Ontology)条目中,10968条Unigenes被注释到25个COG (Clusters of Orthologous Groups)基因簇中,15995Unigenes被注释到119个KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代谢通路中;RT-PCR验证结果表明,随机挑选的30条Unigenes中,26条能扩增出预期长度的cDNA片段,功率为86.7%。 3. Unigene表达量注释和差异基因表达分析显示:65340条Unigenes中,共有64694条在盐胁迫前后的表达量发生了变化,包括上调基因32697条和下调基因31997条;5032Unigenes为显著差异表达基因(Differentially Expressed Gene, DEG),包括2370条上调DEGs和2662条下调DEGs,1947条DEGs富集分布在27个GO条目中,2086条DEGs富集分布在33个KEGG代谢通路中;在Unigene注释结果中,共有135、72和25条Unigenes被注释为K+吸收、H+运输及Na+外排基因,298条Unigenes为活性氧清除系统相关基因,结合它们的表达模式探讨了离子平衡调节和活性氧清除系统在长叶红砂盐胁迫响应中发挥的作用;30条随机挑选Unigenes的qRT-PCR检测结果与它们的数字基因表达计算数据基本一致。 4.利用DDRT-PCR技术结合本地比对分析快速从海量转录组数据库中筛选耐盐基因。经qRT-PCR验证,DDRT-PCR分离得到的18条基因的表达模式与它们的数字基因表达量注释结果高度一致,可作为下一步深入研究该植物耐盐分子机制的候选基因。 5.在65340条Unigenes中共发现225种、6215个简单重复序列,出现频率为10%;4153条Unigenes可设计出SSR扩增引物,成功率为66.82%;220对随机挑选的SSRs引物中,217对能扩增出PCR产物。

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