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Cylindrocladium Canadense侵染对牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)光合特性的影响以及牡丹病程相关蛋白1基因的克隆和遗传转化

【摘要】:牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)被誉为“花中之王”,因具有极高的观赏价值和药用价值而受到极大的重视。随着牡丹栽培面积的扩大,其病害发生日益严重。特别是牡丹柱枝孢叶斑病(Cylindrocladium canadense)发生普遍、病情迅速。牡丹光合作用影响牡丹的成花,而病害对牡丹光合特性的影响鲜有报道。减轻病害危害,寻求抗病相关基因进行遗传转化是一条简便可行的途径。而病程相关蛋白1(pathogenesis-related protein1, PR1)是病程相关蛋白中重要的一类,被看做系统获得抗性的分子标记。发现的许多PR1与抗真菌有密切关系,但牡丹病程相关蛋白1(PsPR1)还不清楚。对PR1基因的克隆与功能分析是抗病基因研究领域的热点之一。本研究中重要研究内容及结论如下: 1、以牡丹‘藏枝红’为试验材料,利用同时测定的快速叶绿素荧光动力学曲线和820nm光吸收(△I/Io)的相对变化,结合气体交换参数和其它生理指标的测定,研究C.canadense侵染对牡丹光合特性的影响。 ①C. canadense侵染牡丹叶片后,叶片迅速出现病斑,随着侵染时间的延长,病斑不断扩展。牡丹叶片净光合速率(Pn)和气孔导度不断下降,但细胞间隙CO2浓度升高;同时,叶绿素a、叶绿素b、叶绿素a/b以及类胡萝卜素的含量都在显著减少,这表明Pn降低是受非气孔因素的影响。 ②通过测定牡丹叶片光合速率的日变化,发现C. canadense侵染后牡丹叶片Pn日变化与对照相比均呈双峰曲线,但Pn值大小与对照相比有显著降低。对光强-光合响应曲线和C02-光合响应曲线的测定,结果表明:C. canadense侵染后牡丹叶片的光饱和点、C02饱和点,表观量子效率和羧化效率均显著降低,这说明C. canadense侵染使碳同化受阻,增强了光抑制。 ③C. canadense侵染牡丹叶片后叶绿素荧光诱导动力学曲线发生显著变化,最大光化学效率(Fv/Fm)和基于光吸收的性能指数(PIABS)以及PSⅡ实际光化学效率(φPS Ⅱ)均显著下降。叶片线性电子传递速率(ETR)和光合机构捕获的激子将电子传递到QA下游电子受体的概率(ψo)均在下降,说明PSⅡ的相对电子传递能力下降,光合机构受损。K点相对可变荧光(WK)显著升高,表明PS Ⅱ电子供体侧受到伤害。但由于VJ和dV/dto在不断升高,表示QA-的积累量在增加,说明PS Ⅱ受体侧受到的伤害比供体侧严重。 ④C. canadense侵染使PSⅡ有活性反应中心数量(RC/CSo)显著下降,但有活性反应中心光能的吸收(ABS/RC)、光能的捕获(TRo/RC)以及激发QA的能量在增多,加重了有活性的反应中心负担,过剩激发能增加,诱导更多的活性氧产生,对反应中心造成进一步的伤害。 ⑤C. canadense侵染使PS I活性快速下降,影响了PSⅡ向PSI的电子传递。通过研究ψo与820nm相对光吸收值(△I/Io)大小之间的线性,发现侵染使PS I和PS Ⅱ之间的协调性遭到破坏。 ⑥C. canadense侵染牡丹叶片后,抗氧化酶活性发生显著变化。超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性在侵染5d先略有升高,然后呈显著下降趋势;过氧化物酶(POD)和抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性一直在降低。超氧阴离子自由基(O2-·)产生速率和过氧化氢(H2O2)积累量明显增加,丙二醛(MDA)含量显著升高。这表明由于C. canadense的侵染使抗氧化酶活性有不同程度的下降,导致活性氧(ROS)含量增加,对生物膜系统造成伤害,从而影响位于光合膜上的光系统的活性。 综述研究结果推断:C. canadense侵染牡丹叶片,使其抗氧化酶活性降低,ROS积累量增加,对PSⅠ和PSⅡ的功能均造成伤害。PSⅠ活性的快速下降阻碍了PSⅡ向PSⅠ的电子传递,过剩激发能增加,导致ROS进一步升高,抑制D1蛋白的合成,加剧了对PSⅡ伤害,降低了牡丹叶片的光合能力,这是C. canadense侵染抑制牡丹光合作用的主要原因。 2、以牡丹‘鲁菏红’为材料,根据已发表植物PRl的保守区域设计兼并引物,利用RT-PCR和RACE技术,获得牡丹病程相关蛋白1基因的全长cDNA,命名为PsPR1。 ①该序列全长为744bp,5’和3’非翻译区分别有42bp和225bp。该基因有477bp的开放阅读框(ORF),编码158个氨基酸,成熟蛋白分子量17.06kD,等电点PI=6.56。PsPR1’基因的推定蛋白具有一个21个氨基酸的信号肽,存在跨膜结构域。该蛋白具有保守的SCP_PR-1_like结构域,形成4个a-螺旋结构和4个p-折叠结构,包含有6个保守的丝氨酸残基,能形成3对二硫键。这表示PsPR1基因就是PR1在牡丹中的同源基因。 ②通过Blast比对分析,发现该基因与多种植物病程相关蛋白1基因具有高度同源性,其中与葡萄(Vitis hybrid)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)同源性分别为67%和64%,亲缘关系较近,而与单子叶植物水稻(Oryza sativa)的同源性稍低,为50%,亲缘关系较远。 ③通过实时荧光定量PCR检测,发现PsPR1基因在牡丹不同组织中表达量有显著差异,萼片中相对表达量最高,正常生长的叶片中最少。该基因受病原菌C. canadense和信号物质水杨酸(SA)的显著诱导,分别在处理的24h和12h达到最高峰。这表明PsPRl基因可能在牡丹的生长发育以及牡丹的抗病防御过程中发挥重要作用。 ④为了对PsPR1基因功能进行研究,构建了PsPR1基因的超表达载体,通过农杆菌介导法将PsPR1基因转入普通烟草NC89中。经过抗性筛选检测和转化烟草RT-PCR检测,获得含PsPR1转基因植株。并对转化烟草的T0代植株进行抗病性鉴定,发现转PsPR1基因烟草能显著增强对烟草赤星病和黑胫病的抗性,说明PsPR1基因具有抵抗病原菌A.alternate和P. parasitica var. nicotianae的功能。

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