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DNA适体基荧光金属纳米簇对金属离子及生物分子的turn-on检测

【摘要】:核酸适配体具有与靶分子高亲和力和高特异性结合的特性,因此被广泛应用于生物和化学传感器的构建。Ag NCs和Cu/Ag NCs由于具有好的光稳定性、低毒性、极好的生物相容性和超小尺寸等优点,被作为荧光探针、光致发光和电致发光材料用于生物标记、生物成像和生物检测。特别是DNA-Ag NCs和DNA-Cu/Ag NCs通过改变碱基序列或寡核苷酸的链长使发射从蓝色到近红外荧光变化的特性,以及Ag~+和Cu~(2+)与DNA寡核苷酸的杂环碱基而不是磷酸和糖环选择性地结合,另外,稳定Ag NCs和Cu/Ag NCs的DNA模板容易和识别靶标的核酸适配体结合等特点,引起研究者极大的关注。基于上述思路,我们构建了检测金属离子和生物分子的免标记“turn-on”式的适配体荧光DNA-Ag NCs/Cu Ag NCs探针。DNA模板一般由两部分组成,一部分是位于5’和/或3’端的成核序列,另一部分是位于中间的适配体序列,二者之间还有几个其它连接碱基。通过改变成核序列和连接序列碱基的种类及数目,以及选择最佳适配体优化DNA模板。检测原理为:加靶标之前,荧光较弱的DNA-Ag NCs/Cu Ag NCs位于DNA模板两端,;加入靶标后,靶标与适配体特异性的结合使得适配体的构象发生改变,促使DNA模板两端的DNA-Ag NCs/Cu Ag NCs互相靠近,导致荧光增强,实现了对靶标的检测。论文的主要研究内容和结果如下:(1)荧光DNA-Ag NCs对Pb~(2+)“turn-on”式的检测。设计了三个DNA模板,分别为C-PS2.M、C-T30695和C-AGRO100。其中两端Ag NCs成核序列(富C序列)相同,但中间适配体不同。根据三种DNA-Ag NCs探针对Pb~(2+)的敏感性,选择C-PS2.M-DNA-Ag NCs作为最佳探针。C-PS2.M-DNA-Ag NCs平均粒径约为1nm。C-PS2.M-DNA-Ag NCs对Pb~(2+)检测的线性范围为5-50 nM(R=0.9862),检测限为3.0 nM。该探针成功地应用于铅的标准参考物质和实际水样中Pb~(2+)的检测。(2)荧光DNA-Ag NCs对Hg~(2+)“turn-on”式的检测。依据T-Hg~(2+)-T配位的特点,设计了2个DNA模板,分别为C-Hg~(2+)-Aptamer-1和C-Hg~(2+)-Aptamer-2。C-Hg~(2+)-Aptamer-1适配体为富T并包含少量C的序列,C-Hg~(2+)-Aptamer-2适配体为富T序列,二者两端Ag NCs的成核序列(富C序列)相同。二者都可以对Hg~(2+)进行检测,线性范围均为2-18 nM(R(1)=0.9985,R(2)=0.9972),检测限分别为0.25nM和0.8 nM,前者比后者更灵敏。C-Hg~(2+)-Aptamer-1-Ag NCs的平均粒径约为2 nm。该方法可以检测自来水和湖水中的Hg~(2+)。(3)荧光DNA-Cu/Ag NCs对三磷酸腺苷(Adenosine 3-triphosphate简称ATP)“turn-on”式的检测。根据ATP适配体设计了BT3T3模板,以BT3T3为基础,通过改变连接区碱基个数、种类以及优化成核富C序列进一步设计了8个DNA模板,并合成了相应的Cu/Ag NCs。对ATP检测效果最好的探针为BT5T5-Cu/Ag NCs。BT5T5-Cu/Ag NCs的平均粒径为2 nm左右,加入ATP后,粒径为1-2 nm的百分含量增加,ATP的加入可能使BT5T5-Cu/Ag NCs得到分散。在2-18 mM线性范围内(R=0.9975),ATP检测限为6.983μM,此探针可以检测胎牛血清中的ATP。BT5T5-Cu/Ag NCs对ATP的检测效果比BT5T5-Ag NCs更好。另外,因为腺苷脱氨酶(Adenosine deaminase简称ADA)可以使ATP不可逆地脱去一个氨基而形成肌苷三磷酸(Inosine 3-triphosphate简称ITP),因此利用BT5T5-Cu/Ag NCs/ATP复合体系可以对ADA的活性检测,检测到的最低浓度为5 U/L。根据在ATP检测中选出的DNA模板,改变结合凝血酶的适体序列,但保留两端的成核序列不变,进一步设计了2个DNA模板,研究发现以TBA1模板合成的TBA1-Cu/Ag NCs能够灵敏地和选择性地检测TB。在2-10 U/L的线性范围内,可以检测到TB的最低浓度为2 U/L。另外,利用本检测方法成功地对胎牛血清中的凝血酶进行了检测。(4)Ag~+、生物硫醇和乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase简称AChE)活性的检测。构建了一个检测Ag~+、生物硫醇和AChE活性的免标记荧光传感器,它是基于Ag~+与Thiazole Orange(简称TO)/G-四链体复合物中的G-四链体作用,以及生物硫醇和AChE水解硫代乙酰胆碱(Acetylthiocholine chlorid简称ATCh chloride)生成的硫代胆碱(Thiocholine简称TCh)(含巯基,类似于生物硫醇)夺取DNA中的Ag~+引起DNA的构象变化导致TO/G-四链体复合物荧光的变化,根据荧光的变化实现对上述物质的检测。设计了三条富G序列DNA,即HTG,C-KIT和C-MYC,经过优化筛选出HTG序列进行检测。结果表明在线性范围0.5-6.0μM(R=0.9978),Ag~+的检测限为34 nM;在0.25-4.5μM(R=0.9965)线性范围,Cys的检测限为25nM;在0.05-1.3 U/L,AChE能被检测到的最低浓度为0.05 U/L。检测AChE活性的实验可以用来检测AChE的抑制剂他克林,其IC_(50)值为18.6 nM。另外,此检测体系成功地检测了自来水和湖水中的Ag~+。因此,本传感器可以拓展到监测环境和生物样品中的Ag~+、生物硫醇和AChE活性,筛选AChE抑制剂,发现新药物,监测和评估有毒农药等。总之,基于适配体荧光DNA-Ag NCs和DNA-Cu/Ag NCs的探针具有操作简单、成本低廉、灵敏度高、选择性好、毒性较低和生物相容性好等优点,因此在环境监测、生物样品检测、生物化学研究、医学诊断和生物分析中具有潜在的应用价值。

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