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氢气对非小细胞肺癌进展的抑制作用及其机制探究

【摘要】:第一部分不同浓度氢气干预对非小细胞肺癌细胞的影响目的:探讨不同浓度氢气干预对非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)细胞A549及H1975增殖、迁移、侵袭、克隆形成能力及细胞凋亡的影响。方法:1.通过CCK-8实验评估不同浓度氢气对人正常肺上皮细胞BEAS-2B的IC50值(half maximal inhibitory concentration,IC50)。2.克隆形成实验和CCK-8实验观察不同浓度氢气对A549和H1975细胞克隆形成和增殖的影响。3.细胞划痕和transwell实验研究不同浓度氢气对A549和H1975细胞迁移和侵袭的影响。4.流式细胞术检测不同浓度氢气对A549和H1975细胞周期及细胞凋亡的影响。结果:1.氢气对人正常肺上皮细胞BEAS-2B的IC50为77±1.36%。2.CCK-8结果显示经60%,80%氢气组干预后A549和H1975细胞在第72h时与对照组相比,抑制细胞活性作用具有显著性差异(P0.01),80%氢气组抑制作用最明显(P(27)0.001)。克隆形成实验结果显示60%,80%氢气干预后14d,A549和H1975细胞与对照组相比克隆形成率降低(P0.05),且80%氢气组效果最明显(P(27)0.001)。氢气抑制肺癌细胞增殖的作用呈浓度依赖性特点。3.流式细胞术检测结果显示与对照组相比,经40%,60%,80%氢气干预后A549和H1975细胞周期阻滞在G2/M期(P0.05)。40%,60%,80%氢气干预组促进了细胞凋亡(P0.05),80%氢气干预组促进细胞凋亡作用最明显(P(27)0.001),其作用呈浓度依赖性特点。4.细胞划痕实验结果显示与对照组相比,氢气对肺癌细胞迁移呈浓度依赖性抑制作用,60%、80%氢气干预组可抑制细胞迁移活性(P0.01)。5.Transwell细胞侵袭实验结果显示40%、60%、80%氢气干预组A549和H1975细胞通过transwell小室基质胶的贴壁细胞少于对照组(P0.05),其中80%氢气干预组作用最为明显(P0.001)。小结:1.氢气对人正常肺上皮细胞BEAS-2B的IC50为77±1.36%。2.浓度60%,80%氢气干预对A549和H1975细胞增殖、克隆形成具有显著抑制效果,其作用呈现浓度依赖性特点,可导致细胞周期阻滞在G2/M期。3.浓度60%,80%氢气干预对A549和H1975细胞侵袭、迁移能力具有显著抑制效果,其作用呈现浓度依赖性特点。4.浓度40%,60%,80%氢气干预可促进A549和H1975细胞凋亡作用,其作用呈现浓度依赖性特征。第二部分氢气干预非小细胞肺癌细胞转录组学分析目的:通过对60%氢气干预后的A549细胞进行转录组测序,分析第一部分中氢气对肺癌细胞影响的作用机制信号通路,选择目标信号通路,筛选差异表达基因进行验证实验。方法:对提取细胞中RNA进行转录组测序,采用生物信息分析方法对差异基因信号通路进行分析。结果:1.氢气干预组与对照组相比,筛选出差异基因823个,其中表达量上调的基因有168个,下调的基因有655个。2.富集GO Terms结果表明下调的差异基因功能涉及染色体结合,DNA复制、修复等细胞周期相关的生物学过程。3.KEGG信号通路分析发现经氢气干预后的A549细胞差异基因主要与细胞周期、DNA复制和有丝分裂等信号通路有关。4.筛选得到与细胞周期及染色体凝集相关的染色体结构维持蛋白(structural maintenance of chromosomes protein,SMC)基因家族中SMC3,SMC5,SMC6及剪接B样蛋白(nipped-B-like protein,NIPBL)基因。小结:1.转录组生物信息分析结果显示氢气干预后肺癌细胞周期及染色体复制相关信号通路受到显著影响,揭示了60%氢气干预组抑制A549细胞生长主要是通过调整细胞周期而实现。2.挖掘出经氢气干预明显变化且与染色体凝集相关的SMC2、SMC3、SMC4、SMC5、SMC6及NIPBL基因进行下一步深入验证。第三部分氢气通过抑制染色体凝聚抑制肺癌细胞增殖目的:对第二部分筛选的差异表达基因进行验证分析。检测氢气对SMC3蛋白稳定性的影响。探讨SMC3过表达对A549和H1975细胞迁移、侵袭及细胞凋亡的影响。方法:1.QPCR及Western Bolt方法对A549和H1975细胞内SMC2、SMC3、SMC4、SMC5、SMC6及NIPBL基因及蛋白水平进行分析。2.对A549和H1975细胞中SMC3蛋白的表达进行免疫荧光检测。3.加入放线菌酮处理对照组及60%氢气干预组A549和H1975细胞,对氢气干预细胞内SMC3蛋白稳定性进行分析。免疫沉淀实验检测氢气干预对SMC3蛋白泛素化的影响。4.构建SMC3蛋白过表达A549和H1975细胞。将A549和H1975细胞各分为3组:对照组,氢气干预肺癌细胞组,氢气干预转染后肺癌细胞组。对细胞迁移、侵袭及细胞凋亡进行分析。结果:1.QPCR及Western Blot结果显示SMC3、SMC5、SMC6及NIPBL较对照组表达下调,其中SMC3蛋白在氢气干预后下降趋势最为明显。2.免疫荧光检测结果显示细胞分裂过程中,氢气干预组SMC3蛋白表达量较对照组降低。3.60%氢气干预可下调A549和H1975细胞中SMC3蛋白表达,而SMC3过表达可部分逆转氢气对A549和H1975细胞迁移、侵袭抑制作用及促进细胞凋亡作用。小结:1.氢气抗肿瘤进展作用机制可能与染色体凝聚有关。氢气干预可下调A549和H1975细胞中SMC3基因及蛋白水平表达。2.成功建立了SMC3过表达A549及H1975细胞系。3.SMC3过表达肺癌细胞部分逆转了氢气对肺癌进展的抑制作用。推测氢气干预通过调节SMC3蛋白表达的方式对肺癌进展发挥了抑制作用。第四部分氢气对非小细胞肺癌生长的影响在体实验目的:探讨60%氢气干预对裸鼠皮下移植瘤增殖的影响,在体水平研究氢气对肺癌抑制作用的机制。探讨SMC3在肺癌组织及癌旁组织中的表达情况及SMC3表达量与肺癌患者生存时间关系。方法:1.构建A549细胞荷瘤动物模型,并观察移植瘤的生长情况。2.留取裸鼠肺脏及移植瘤组织标本,免疫组织化学方法对标本中肿瘤组织中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、Ki67、SMC3及环氧化酶2(cyclooxygenase-2,COX-2)蛋白表达情况进行分析。3.利用网络公共临床标本数据库对选取数据标本中SMC3表达情况及SMC3与肺癌患者生存时间的关系进行分析。结果:1.氢气干预组、顺铂组移植瘤重量较对照组明显减轻(P(27)0.05);氢气干预组对肿瘤生长的抑制作用不及顺铂组明显。2.氢气干预未造成裸鼠正常肺组织形态发生病理改变。3.氢气干预可使移植瘤组织中VEGF、Ki67、SMC3及COX-2蛋白表达降低。4.SMC3在肺癌组织中表达量高于癌旁正常组织。SMC3低表达肺癌患者生存期较SMC3高表达患者生存期明显延长(P(27)0.05)。小结:1.60%氢气干预未造成裸鼠肺组织形态发生病理改变。2.60%氢气干预可抑制移植瘤瘤体生长,但其作用不及顺铂明显。3.60%氢气干预后移植瘤组织中VEGF、Ki67、SMC3及COX-2表达水平降低,说明肺癌细胞的增殖活性降低。4.SMC3在肺癌组织中表达高于癌旁正常组织。SMC3低表达的肺癌患者生存期较SMC3高表达患者生存期明显延长,提示SMC3可能成为肺癌的肿瘤标志物之一。结论:1.浓度60%,80%氢气对A549和H1975细胞的增殖、侵袭转移及克隆形成能力具有显著抑制效果,并可促进肺癌细胞凋亡,其作用呈浓度依赖性特征。2.氢气抑制A549和H1975细胞生长的作用机制可能是通过抑制SMC3表达,进而改变其细胞周期而实现的。3.60%氢气干预未造成裸鼠肺组织形态发生病理改变。4.60%氢气干预可使移植瘤重量明显减少,瘤体组织中VEGF、Ki67、SMC3及COX-2蛋白表达降低。5.SMC3高表达是肺癌患者总生存时间的不利因素,SMC3可能成为肺癌治疗的新靶点。

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