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PD-1删除后T细胞抗肿瘤作用的实验研究

【摘要】:免疫系统在癌症的发展中起着关键作用,正常情况下免疫系统能够识别、控制甚至于消除肿瘤。细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTLs)亦被称为CD8~+T细胞或者杀伤性T细胞,是负责杀伤肿瘤细胞的主要免疫细胞。程序性细胞死亡蛋白1(programmed cell death protein 1,PD-1)表达于T细胞表面。当PD-1与其配体(PD-1 ligand,PD-L1)相结合后,产生抑制信号从而抑制T细胞的活性。PD-L1可以表达于多种类型的细胞,PD-1/PD-L1通路在维持免疫系统自身耐受和生理免疫反应的平衡中起着至关重要的作用。许多肿瘤细胞也表达PD-L1,肿瘤细胞可以利用PD-1途径抑制T细胞活性,从而逃避CTLs对其识别同时避免CTLs对其杀伤,在这种情况下PD-1/PD-L1的检查点功能阻断了肿瘤的免疫周期,调节效应性T细胞对于肿瘤细胞的反应是PD-1的主要功能。据报道,PD-1水平的升高与肿瘤患者的T细胞耗竭或长期刺激及生存不良有关。当前,PD-1/PD-L1通路的阻断是治疗癌症的一种有效治疗方式,在肺癌患者和晚期恶性血液病患者的治疗中都取得了显著的进步。在这项研究中,我们通过规律成簇间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)和CRISPR相关蛋白9(CRISPR-Associated protein 9,Cas9)系统在CTLs中编辑敲除了PD-1基因从而打断了PD-1/PD-L1通路,然后我们研究了PD-1敲除(PD-1knockout,PD-1 KO)后效应T细胞的抗肿瘤活性。第一部分构建CRISPR/CAS9载体转染T细胞删除PD-1目的:应用基因编辑技术crispr/cas9构建有效载体转染T细胞删除其内表达的PD-1。方法:设计非靶向引导RNA序列和3个PD-1引导RNA序列分别克隆到载体lenticrispr V2中,将293 T细胞与载体共培养生成慢病毒,慢病毒与T细胞共培养以转染T细胞删除PD-1基因,从而获得PD-1 KO CTLs。流式细胞术检测转染T细胞效率,转染后T细胞存活率,Western blot检测PD-1蛋白在CTLs细胞的表达情况。结果:1.成功设计非靶向引导RNA序列和3个PD-1引导RNA序列,并克隆到载体lenticrispr V2中。2.成功获得含有PD-1引导RNA序列的慢病毒,转染T淋巴细胞后获得PD-1敲除后的CTLs细胞,流式细胞术检测转染效率约为28.5%。3.Western blot检测PD-1敲除后的CTLs细胞中PD-1的表达,结果显示PD-1的总表达显著降低,表明在转导的CTLs中PD-1KO是有效的。第二部分PD-1删除T细胞体外抗肿瘤作用的实验研究目的:观察研究PD-1 KO CTLs细胞在体外抗肿瘤的作用。方法:分别将实验组PD-1 KO CTLs,对照组CTLs与多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)细胞共培养,检测MM.1S细胞的活力。通过WST-1方法检测两组细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤活性。应用AnnexinV/7-AAD染色MM.1S细胞,流式细胞术分析肿瘤细胞凋亡,然后用不同的caspase底物孵育MM.1S细胞裂解液,检测其caspase活性。酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞因子TNF-α和IFN-γ的分泌量。结果:1.与对照组CTLs相比PD-1 KO CTLs抗肿瘤细胞毒作用增强。2.与对照组CTLs相比PD-1 KO CTLs诱导肿瘤细胞凋亡能力增强并增强caspase活性,caspase-3、caspase-8和caspase-9活性分别是对照组的8.21±0.47、6.58±0.41和4.92±0.35倍。3.ELISA检测显示PD-1 KO CTLs分泌的TNF-α和IFN-γ分别为对照组的2.43±0.18和1.92±0.21倍。第三部分PD-1删除T细胞体内抗肿瘤作用的实验研究目的:研究观察PD-1 KO CTLs细胞在MM移植瘤小鼠模型体内的抗肿瘤作用。方法:通过鼠尾静脉注射外周血单个核细胞的方法构建人源化的NOD/SCID小鼠模型,流式细胞术检测小鼠外周血中人CD3~+T淋巴细胞和CD19~+B淋巴细胞的表达情况。利用人源化NOD/SCID小鼠制造MM移植瘤动物模型,成瘤后将动物随机分为2组进行试验,分别给予PD-1KO CTLs(实验组)、CTLs(对照组)细胞治疗4次,每隔一天用卡尺测量肿瘤大小。计算各组移植瘤的平均体积和SD值。肿瘤体积达到2000mm~3时处死小鼠。用Kaplan-Meier法分析总生存期。结果:1.NOD/SCID小鼠人源化后其外周血中检测到人CD3~+T淋巴细胞和CD19~+B淋巴细胞的表达,且表达比例在正常成人水平,表明人源化成功。2.NOD/SCID小鼠MM移植肿瘤2周后可观察到,并且PD-1KO CTLs治疗组小鼠的肿瘤生长与CTLs治疗组相比明显受到抑制。3.CTLs治疗组小鼠于52天内全部死于进展期移植肿瘤,相比之下PD-1KO CTLs治疗组只有40%的小鼠同期死亡。结论:1.CRISPR-Cas9系统可以有效地在CTLs之中敲除PD-1基因。2.PD-1基因敲除增强了CTLs对肿瘤细胞的细胞毒作用,诱导肿瘤细胞凋亡能力增强并增强caspase活性,可能是通过影响caspase蛋白相关通路的作用而促进肿瘤凋亡,细胞因子TNF-α和IFN-γ的分泌量明显升高。3.通过鼠尾静脉注射外周血单个核细胞的方法成功构建了人源化的NOD/SCID小鼠模型,并成功制造人MM移植瘤模型。PD-1KO CTLs细胞在体内展现出良好的抗肿瘤作用,有效地抑制了人MM细胞在体内生长,显著提高了移植小鼠的整体存活率。

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