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PD-1抗体和外泌体激活的树突状细胞联合治疗前列腺癌的实验研究

【摘要】:前列腺癌(Prostate cancer,PCa)是发达国家常见的恶性肿瘤之一,具有较高的发病率和死亡率。前列腺癌一旦发生转移,患者的预后会非常差。发生转移的患者接受内分泌治疗(Androgen deprivation therapy,ADT)后通常效果显著,但最终因生化复发发生疾病进展,变为去势抵抗性前列腺癌(Castration-resistant prostate cancer,CRPC),大部分前列腺癌相关的死亡都发生在转移性去势抵抗性前列腺癌阶段。在众多的针对前列腺癌的治疗中,免疫治疗已逐渐成为一种完善的治疗手段,诸如重组病毒肿瘤疫苗PROSTVAC、肿瘤疫苗Sipuleucel-T以及免疫检查点抑制剂(PD-1,CTLA-4等)被证明可以有效的延长前列腺癌患者的总体生存率(Overall survival,OS)。以肿瘤相关抗原为基础的融合蛋白作为抗原的肿瘤疫苗,如Sipuleucel-T虽然能有效的提升患者的总体生存率,但是针对疾病进展的作用有限。同时单一的免疫检查点抑制剂在前列腺癌治疗中效果也较为局限。因此,一方面寻找肿瘤特异性的新型抗原,高效率地促使树突状细胞摄取并提呈给T细胞,从而产生有效并且特异性强的抗肿瘤免疫反应十分重要;另一方面,前列腺癌的肿瘤疫苗联合免疫检查点抑制剂不仅可以招募肿瘤特异性毒性T细胞,还能够增加T细胞的效应功能,因此在提高前列腺癌治疗效果方面展现出巨大的潜力。本研究旨在探索前列腺癌细胞来源的外泌体(Tumor cell derived-exosomes,TEX)能否作为新型抗原,刺激并激活树突状细胞(Dendritic cell pulsed with TEX,DC-TEX),将其作为肿瘤疫苗观察其在体外和体内杀伤肿瘤细胞的效果,同时针对PD-1/PD-L1这条耗竭T细胞功能的通路,引入PD-1抗体,分别在体内和体外水平评估其是否能够提高DC-TEX治疗前列腺癌的效果,为两种不同机制的免疫治疗联合应用提供理论支持。目的:1.分离肿瘤细胞的外泌体,在体外和体内水平探讨DC-TEX的抗肿瘤免疫效果;2.在体外和体内水平验证PD-1抗体是否能够增强DC-TEX治疗前列腺癌的效果。方法:1.利用超速离心的方法分离肿瘤细胞分泌的外泌体,通过Western blot、透射电镜以及纳米颗粒跟踪分析技术(Nanoparticle Tracking Analysis,NTA)鉴定外泌体,分析其性征及特点,并通过荧光染色技术观察其能否被树突状细胞摄取,并通过流式细胞术、ELISA实验以及细胞毒性实验来确定DC-TEX的活化情况和T细胞杀伤肿瘤细胞情况;2.通过Western blot和流式细胞术分析肿瘤细胞PD-L1的表达情况以及T细胞表面PD-1表达情况,通过细胞毒性实验以及ELISA实验探索PD-1抗体是否能够逆转DC-TEX激活的CD8+T细胞因表达PD-1受体而导致耗竭的状态;3.通过移植瘤块的方式建立经济、快速成瘤的野生型C57/BL6小鼠皮下前列腺肿瘤模型,体内水平通过观察及测量小鼠肿瘤体积、重量、生长速率以及生存率来评估DC-TEX和PD-1联合DC-TEX的治疗效果,流式细胞术以及免疫组化实验验证DC-TEX募集和活化T细胞的能力以及对全身免疫系统的影响,通过ELISA评估活化T细胞的功能状态。结果:1.成功分离出前列腺癌细胞分泌的外泌体,并通过Western blot、透射电镜以及NTA技术验证其形态、大小以及分子标记物符合外泌体特征,并且富含多种前列腺癌免疫相关的抗原;2.DC2.4细胞能够成功摄取TrampC1分泌的外泌体,并能促进DC2.4细胞的活化,活化的DC-TEX能够促进幼稚的T细胞转化成细胞毒性T细胞,具有较强的靶向杀伤肿瘤细胞的能力;3.证实前列腺癌细胞以及前列腺癌组织中表达PD-L1,在体外实验中,通过流式细胞术、ELISA实验以及细胞毒性试验证明DC-TEX联合PD-1抗体能够逆转DC-TEX激活的CD8+T细胞因表达PD-1受体而导致耗竭的状态;4.成功建立C57/BL6小鼠的皮下前列腺癌模型,发现DC-TEX联合PD-1抗体组能够有效的延长小鼠的生存期,小鼠肿瘤生长速率明显减缓,体积明显下降,通过流式细胞术、免疫组化和ELISA实验发现全身免疫系统处于激活状态。结论:1.外泌体激活的树突状细胞对比肿瘤裂解物,具有更强的抗肿瘤免疫效果;2.PD-1抗体能够增强DC-TEX杀伤肿瘤的效果,PD-1联合DC-TEX能起到协同抗肿瘤作用,对于提高前列腺癌患者的临床预后具有很大的潜力。

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