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Ki-67和IRF-1预测HCC肝移植预后的临床及机制研究

【摘要】:一、肝切除术后HCC复发患者行肝移植的预后分析目的:通过初发HCC肝移植和HCC复发后肝移植的移植物生存比较,明确肝切除术后HCC复发患者行肝移植对肝移植预后的影响。方法:对2000年1月1日至2011年12月31日间于天津市第一中心医院行肝移植的患者病史资料和生存资料进行回顾分析。最终1554名患者纳入研究。根据移植前HCC情况分组,包括初发HCC组1392例,复发HCC(因HCC复发行肝移植)组162例。结果:全部病例的分析中,初发HCC组与复发HCC组的移植物生存曲线存在显著的统计学差异(P=0.030);Cox回归分析显示:初发/复发HCC(P=0.049)、MELD评分(P0.001)、Milan标准分组(P=0.022)和UCSF标准分组(P0.001)对移植物生存存在独立影响。亚组分析中,Cox回归分析显示:Milan-UCSF标准分级是复发HCC的唯一独立危险因素(P=0.023)。符合Milan标准的肝癌患者中,初发HCC(768例),复发HCC(61例)移植物生存曲线无统计学差异(P=0.292)。超出Milan标准但符合UCSF标准的肝癌患者中,初发HCC(304例)和复发HCC(63例)组的移植物生存曲线存在统计学差异(P=0.046)。结论:HCC复发后的肝移植对术后移植物生存存在独立影响;HCC复发后肝移植的移植物生存与术前肝内复发病灶的分期有关。二、肝移植术后HCC复发与肿瘤生长速度的关系目的:通过肝移植后HCC复发时间(TTR)和肺转移病灶生长速度的相关分析,明确肿瘤生长速度与肝移植术后HCC复发的关系方法:在天津市第一中心医院电子病历系统中,选取2010年1月1日至2013年9月31日间进行肝移植手术且存在肝移植术后肺转移癌的病例。共检索到符合入组条件的肝移植术后肺转移病例32例。在病理组织库中,获得了其中26例的肝癌标本(移植术中切除标本),进行Ki-67免疫组化染色。结果:通过相关分析描述肝癌肺转移患者的TTR与肺转移癌中靶病灶直径增加速度的关系,发现两者显著相关(n=32,P=0.021),而肝癌肺转移患者的TTR与Ki-67表达也存在显著相关(n=26,P=0.045)。结论:HCC生长速度与肝移植术后HCC复发相关。三、Ki-67和IRF-1对肝移植术后HCC复发的预测作用目的:评价分子标记物对肝移植术后HCC复发的预测价值。方法:纳入2012年1月1日至2014年12月31日于天津市第一中心医院进行肝移植手术的全部符合入选标准的肝移植病例,通过免疫组化染色研究了肝癌组织中多种分子标记物表达。通过每种分子标记物的表达情况对入选病例分别进行分组,比较组间无瘤生存率的变化,判定每种分子标记物对肝移植术后无瘤生存的影响。结果:最终纳入127例HCC病例,通过免疫组化分组和无瘤生存比较(结果通过Benjamini-Hochberg法校正),Milan-UCSF标准划分的各分组间(q0.001)、有/无间质脉管癌栓组间(q0.001)、Ki-67阴性/阳性组间(q0.001)和Ki-67低表达/高表达组间(q=0.001)的累积无瘤生存存在统计学差异。Cox回归分析结果显示:Milan/UCSF分期(P0.001)、间质脉管癌栓(P0.001)和Ki-67(P0.001)是肝移植术后无瘤生存的独立危险因素。在超出Milan标准的亚组中,IRF-1阴性与阳性患者的肝移植术后无瘤生存也存在显著差异(q0.001)。在符合UCSF标准的HCC患者中,初发HCC组与复发HCC组的Ki-67阳性比例存在显著差异(P=0.022)。结论:Ki-67可有效的预测的肝移植术后HCC的复发,可用于肝移植术前HCC患者的评估;在符合UCSF标准的HCC患者中,初发和复发HCC的Ki-67表达存在差异,可能是导致两者移植物预后差异的原因之一;IRF-1不适合作为肝移植术后HCC复发的预测指标。但在超出Milan标准的HCC中,IRF-1表达伴随更低的肝移植术后HCC复发。四、IRF-1对HCC细胞凋亡和自噬的影响目的:通过人肝癌细胞系SK-Hep1的体外研究,探索IRF-1对人HCC细胞凋亡和自噬的影响。方法:实验一中,通过MTT检测IFN-γ对SK-Hep1细胞活性的影响。实验二和三中,将SK-Hep1细胞分为:空白对照组,IFN-γ组。通过Western Blot方法测定自噬和凋亡相关蛋白变化。通过DAPI/PI染色荧光显微镜观察和Annexin V-FITC/PI染色流式细胞分析,确定IFN-γ刺激后细胞凋亡的情况。观察荧光双标LC3转染的SK-Hep1细胞IFN-γ刺激后LC3荧光斑变化。观察SK-Hep1细胞IFN-γ刺激后电镜下超微结构改变。实验四中,将SK-Hep1细胞分为:空白对照组,IFN-γ组,Z-VAD-FMK组,Z-VAD-FMK+IFN-γ组。通过Western Blot方法测定自噬相关蛋白变化。实验五中,将SK-Hep1细胞分为:空白对照组,阴性对照组,(IRF-1)si RNA1组,si RNA2组,si RNA3组,si RNANC+IFN-γ组,si RNA1+IFN-γ组。通过Western Blot方法测定自噬相关蛋白变化。结果:SK-Hep1细胞受到IFN-γ刺激后IRF-1、pSTAT1增加,Ki-67降低,LC3-II减少,Caspase-3裂解增加。PI和流式细胞分析显示,IFN-γ刺激后死亡细胞比例增加。在转染了荧光双标LC3的SK-Hep1细胞中,IFN-γ较组对照组LC3荧光聚集减少。透射电镜下IFN-γ刺激的SK-Hep1细胞中自噬体减少。Caspase抑制剂联合IFN-γ处理的SK-Hep1细胞与单独Caspase抑制剂处理时相比,Beclin1、LC3-II、Atg5和Atg7的蛋白量无明显下降。SK-Hep1细胞接受IRF-1si RNA处理后,LC3-II水平和LC3-II/LC3-I比例明显下降。IRF-1 si RNA+IFN-γ组与si RNANC+IFN-γ组相比,LC3-II水平升高,p STAT1降低。结论:在人肝癌细胞系SK-Hep1中:IRF-1可活化STAT1形成对IFN-γ信号的正反馈调节;IFN-γ导致凋亡增加,通过IRF-1表达和Caspase活化导致自噬受抑制;基础水平IRF-1表达对自噬水平的维持非常重要。

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