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玻璃体腔移植人脐带间充质干细胞诱导的神经干细胞对糖尿病大鼠血视网膜屏障保护作用的实验研究

【摘要】:目的建立Sprague-Dawley(SD)大鼠糖尿病模型,通过伊文思蓝(evans blue,EB)灌注大鼠视网膜后在磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)中制作透明视网膜标本,直接在普通荧光显微镜下观察早期糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy,DR)血视网膜屏障(blood-retinal barrier,BRB)功能的改变;通过玻璃体腔移植人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UCMSCs)诱导的神经干细胞(neural stem cells,NSCs),观察其对DR大鼠BRB的影响。方法(1)40只雄性SD大鼠随机分为正常对照(CON)组10只大鼠和糖尿病组30只大鼠。腹腔注射链脲佐菌素(streptozotocin,STZ)建立糖尿病模型,根据病程,将糖尿病组大鼠分为糖尿病1个月(DM-1m)组、糖尿病3个月(DM-3m)组及糖尿病6个月(DM-6m)组;CON组大鼠腹腔注射等容量枸橼酸缓冲液。于各相应时间点经股静脉按45mg/kg注射30g/L的EB溶液,循环15min后摘除双侧眼球,立即置于PBS中完整剥离视网膜,放射状切开并平铺于载玻片上,避光晾至完全透明,封片,置于荧光显微镜下观察并拍照。应用IPP 6.0软件分析图像,测量并比较EB渗漏区面积与视网膜面积的百分比。(2)60只雄性SD大鼠随机分为正常对照组、DR模型对照组及NSCs治疗组,其中正常对照组12只大鼠,DR模型对照组及NSCs治疗组各24只大鼠。DR模型对照组和NSCs治疗组大鼠腹腔注射STZ建立糖尿病模型。于糖尿病成模后3个月,NSCs治疗组大鼠右眼玻璃体腔注射2μl NSCs悬液(2×104/μl);DR模型对照组大鼠右眼注射等容量PBS;上述两组大鼠左眼及正常对照组大鼠双眼不给予任何干预。干预1个月后,采用EB灌注血管视网膜铺片观察视网膜血管形态及渗漏情况;EB定量检测BRB破坏情况;病理学切片观察视网膜组织改变情况。结果(1)糖尿病组大鼠较CON组血糖明显升高,体重明显下降(均P0.05)。CON组大鼠视网膜血管形态和走形正常,红色荧光均匀充盈于血管腔。糖尿病成模1个月时,大鼠视网膜背景荧光较CON组略有增强;3个月时,背景荧光进一步增强,视网膜血管呈节段性扩张,可见明显的红色高荧光区;6个月时,视网膜血管粗细不均,部分走行迂曲,可见片状低灌注区及大量高荧光区。CON、DM-1m、DM-3m、DM-6m组EB渗漏区面积百分比分别为(0.05±0.02)%、(0.27±0.06)%、(1.17±0.18)%及(4.77±0.66)%,总体比较差异有统计学意义(F=795.800,P0.000),其中DM-3m、6m组均明显高于CON组(q’=10.338,q’=43.475;均P0.000)。(2)NSCs治疗组血糖较正常对照组明显升高、体重明显下降(P0.05),与DR模型对照组无明显差异。EB灌注视网膜铺片检查显示,正常对照组大鼠视网膜血管无明显异常,无EB渗漏到血管外;DR模型对照组背景荧光增强,可见明显的EB渗漏高荧光区;NSCs治疗组背景荧光略增强,EB渗漏区较DR模型组明显减少。EB渗漏定量分析显示,DR模型对照组大鼠视网膜平均EB渗漏量较正常对照组增加(P0.05);NSCs治疗组较DR模型对照组明显减少(P0.05)。视网膜组织病理学检查示正常对照组视网膜各层结构清晰、排列整齐、形态正常;DR模型对照组视网膜细胞排列较紊乱,神经纤维层高度水肿,细胞核肿胀、体积增大,细胞密度降低;NSCs治疗组视网膜细胞较DR模型对照组略整齐,神经纤维层水肿明显减轻。结论(1)EB灌注大鼠视网膜后在PBS中制作透明视网膜标本的方法,可在普通荧光显微镜下获得清晰的大鼠视网膜荧光显微镜像;(2)STZ诱导的糖尿病大鼠模型成模3个月时可作为早期DR模型用于实验研究;(3)通过玻璃体腔移植h UCMSCs诱导的NSCs,能够改善BRB功能,减少早期DR大鼠血管渗漏,从而达到防治DR进展的治疗作用。

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