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根霉纤溶酶发酵过程优化及其溶栓作用的试验研究

【摘要】:心脑血管疾病严重威胁人类生命和健康,已经成为我国的主要死亡原因,且发病率近年来呈增长趋势。据近期全国卫生部门统计资料显示,我国现有缺血性脑血管疾病患者500余万人,每年新发病150万人,死亡20余万人,存活者中50%-70%病人遗留瘫痪、失语等严重残疾,给社会和家庭带来严重负担。大量的动物和临床试验均证明溶栓治疗对降低致死率和致残率具有显著作用,但目前临床使用的溶栓药物存在许多缺陷,因此研制高效、快速、副作用小,价廉的新型溶栓药物的需求迫切。微生物是获得溶栓剂的重要来源。 本论文在以前小型发酵的基础上,对根霉纤溶酶的液体和固体发酵工艺进行优化,同时对根霉纤溶酶的急性毒性作用和根霉纤溶酶的药效进行了动物试验。 根霉纤溶酶液体发酵工艺放大试验,研究表明在5L发酵罐试验中,20%接种量,发酵60h,初始pH为4.3时酶活力较高,达到25U/ml。发酵28h后温度变为26℃比30℃恒温发酵的产酶效果好。 采用中国根霉12#进行了固态放大发酵试验,结果表明初始湿度为0.75mL/g含水量,发酵湿度控制在70%,接种量1×10~7个/g,发酵前30h通风量为0.8vvm,发酵30h后通风量为0.7vvm,30℃发酵时间60h,产酶活力最高。 研究并确定了分离根霉纤溶酶的制备色谱优化工艺流程。根据目标酶的基本性质,选择了载量大、制备速度快的疏水层析色谱及强阳离子交换色谱模式并进行合理组合,确定的目标酶色谱分离流程为Octyl-Sepharose Fast Flow、Phenyl-Sepharose HP、SP-Sepharose HP。用高分离度Resource Phe色谱和SDS-PAGE方法检验得到的根霉纤溶酶纯度,证明其组分均一,并达到电泳纯。 本研究表明,用最大浓度最大给药量对动物尾静脉注射后,连续14天观察未见动物死亡。测得根霉纤溶酶对小鼠静脉给药途径的LD_(50)应为最大耐受剂量,大于25.0g/kg.bw,动物解剖后,与正常对照组比较,大体观察胸腹腔未见积液,肝、肾、脾、胃肠、肺、心脏大小、外观、色泽未见异常,无充血、出血、水肿变化,说明该药实际无毒。 将雌雄Wistar大鼠通过电流损伤法制成血栓模型,结果显示,肉眼可见颈

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