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人骨髓间充质干细胞及其在骨组织工程应用的实验研究

【摘要】:骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cell,MSCs)是骨髓中存在的一种具有多分化潜能和高度增殖能力的多能干细胞。在特定的条件下,其能够被诱导分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌细胞、肝卵圆细胞甚至神经胶质细胞。骨髓间充质干细胞具有下列优点:穿刺取材容易;细胞体外分离培养方法简单;体外培养增殖力强,并定向分化为研究所需的细胞表型;因而骨髓间充质干细胞是目前组织工程(尤其骨组织工程)研究较多的种子细胞。我们通过开展人MSCs的细胞生物学特性、定向诱导分化(如:MSCs分离培养、诱导分化的条件、基因转染的影响)以及其在骨组织工程中应用的实验研究,为临床组织工程化人工骨的移植提供了的理论与实验的研究基础。 本研究的内容包括:人MSCs的生物学特性与定向诱导分化;逆转录病毒载体介导的EGFP基因转染人MSCs;骨髓间充质干细胞在骨组织工程中应用等几个方面。 1、人骨髓间充质干细胞的生物学特性 目的:体外分离培养人骨髓间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSCs),研究其一般的生物学特性如细胞生长特点、增值周期、细胞表面分子特点,为其作为组织工程的种子细胞提供理论基础。方法:①运用密度梯度离心方法(1.073g/ml Percoll)分离获得骨髓单个核细胞,应用含10%胎牛血清(经筛选)的L—DMEM体系中培养,除去非贴壁的细胞、进行分离纯化与体外培养从而获得较高纯度的MSCs。研究表明人MSCs为梭形,呈集落样生长。第2~8代细胞生长速度较快,8代以后细胞扩增速度变慢,细胞形态也发生改变,有的呈多角形;②经过流式细胞技术检测细胞表面5种抗原分子的特征,即CD34、CD45阴性、CD29、CD44、CD166阳性,分离细胞的纯度达到95%以上。MSCs的抗原表型不是单一的,具有间质细胞、上皮细胞等细胞的特征,但不表达造血干细胞(HSCs)的标志如CD34;③通过细胞化学染色我们发现人MSCs的糖原染色强阳性、约5%的细胞碱性磷酸酶染色阳性,脂肪(苏丹黑)染色阴性;④运用流式细胞技术测定了人MSCs的细胞周期,结果表明处于G_0/G_1、S和G_2/M期细胞的比例分别为83.11%、5.17%和11.72%,提示大多数的MSCs处于G_0/G_1期,表明MSCs可能具有较高的分化潜能。结果:我们的研究表明,通过密度梯度离心方法分离获得的MSCs纯度高、形态和表型均一,且具有较强的分化潜能。

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