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中成药的DNA条形码鉴定:从mini-barcode到meta-barcode

【摘要】:中成药为我国人民群众常用药品,其质量安全为中医药事业发展的基础。目前根据《中国药典》规定,传统中成药的鉴别方式分为显微观察和化学检测。中成药品种类繁多,制作工艺复杂多样,传统的鉴定方法不能完全对药品成分定性分析,因此不法商家借机在药品中掺假造假,干扰市场秩序,危害消费者健康。本研究以三类中成药为例,从分子诊断角度出发,以DNA条形码为基础,通过DNA mini-barcode和meta-barcode对不同类型的中成药成分进行多方面分析和对比,探索多种分子检测方法,比较不同方法对中成药检测结果的利与弊,为建立适合中成药的分子诊断方法学提供了参考。研究具体内容和方法如下:1.改良中成药DNA提取方法,得到更高纯度DNA;2.基于基原物种条形码序列建立物种数据库,MEGA比对和筛选特异性片段和稳定遗传的SNP位点。通过设计特异性引物对短片段进行PCR扩增,得到DNA mini-barcode。通过下游的琼脂糖凝胶电泳,一代测序等方法对检测结果进行验证;3.结合一代分子克隆测序和二代高通量测序技术对多组分中成药进行DNA meta-barcode分析,利用生物信息学对二代测序结果展开精确到单碱基匹配的结果分析。研究结果如下:1.共收集76份金银花,山银花以及杜仲植物样品。基于杜仲单属单种特性在其ITS2序列开发出特异性的短序列分子身份证。基于金银花,山银花ITS2序列,分析找到了具有稳定遗传的SNP位点,并设计特异性引物扩增带有此SNP位点的DNA mini-barcode序列,通过SNP位点测序峰图粗判金银花/山银花掺伪比例。此方法可以用于对多组分金银花/山银花中成药中混伪品山银花和杜仲两种混伪品的单组分鉴定。对47份金银花中成药的鉴定结果表明,78%的药品中掺杂杜仲或山银花,证实DNA mini-barcode可以对金银花类产品进行有效分子鉴定。2.通过分子克隆和二代测序对中成药蛇胆川贝胶囊/散、川贝末胶囊中贝母成分进行鉴定。20份贝母中成药进行了分子克隆实验,并选取其中三份进行了二代测序,利用其高通量测序可获得大量ITS2的meta-barcode序列。在20份川贝母中成药中均检测出伊犁贝母、平贝母等非标签成分,仅2份含有川贝母。3.以人参健脾丸为例,结合二代测序和分子克隆对多植物组分中成药进行成分鉴定。建立了人参健脾丸药材饮片的对照模型,通过生物信息学对DNA meta-barcode数据进行精准深度分析。在人参健脾丸的阳性对照实验的数据分析中,该分析方法可以成功鉴定11味组方中的9种成分,并成功过滤掉冗余序列,保证测序结果准确性。本研究基于DNA条形码技术,从mini-barcode到meta-barcode对种类多样的中成药成分成功鉴定,提出了不同于传统鉴定的短片段分子诊断方法,该方法进一步拓宽了 DNA条形码在中成药鉴定中的应用范围,并使得鉴定结果更加精准。

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