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基于母子细胞系及其酶消化的胎儿染色体非整倍体无创产前检测游离DNA参考物质的研究

【摘要】:1997年,香港中文大学卢煜明教授在孕妇血浆中发现存在胎儿游离DNA,随着新一代高通量测序(next-generation sequencing,NGS)的出现及成熟,基于血浆游离DNA(cell-free DNA,cfDNA)的胎儿染色体非整倍体无创产前检测(noninvasive prenatal testing,NIPT)成为可能。目前临床上最常用的基于NGS的NIPT方法主要有全基因组大规模平行测序(random massively parallel sequencing,MPS)和靶向测序。NIPT技术创伤性小、无流产风险,且与传统产前检测手段相比检测准确性显著提高。然而由于孕妇血浆中胎儿游离DNA 比例极低,针对其染色体微小差异的比较对检测方法的准确性要求很高,且NIPT流程复杂,不同环节中出现的各种因素,如游离DNA提取、文库制备及GC偏倚纠正等均可导致不同实验室间检测结果的不一致。因此,无创产前检测迫切需要标准化,而制备出接近真实样本的参考物质是进行临床实验室无创产前检测质量保证和实现标准化的关键。国内外现有的无创产前检测参考物质包括天然母体血浆样本和片段化人基因组DNA模拟混合样本,其中临床血浆样本因来源有限而不能在短时间内大量制备,而人工制备的片段化基因组DNA模拟样本,则因不符合天然孕妇血浆遗传学特征和游离DNA生物学特征,不能广泛适用于各种NIPT方法。因此,为解决上述现有无创产前检测参考物质所存在的问题,本研究采用母子细胞系结合细胞凋亡机制中的 DNA 片段化因子(DNA fragmentation factor,DFF)及微球菌核酸酶(micrococal nuclease,MNase)消化技术,制备了一种在体外易于大量获取、生化遗传特性均与天然孕妇血浆样本最为接近的新型胎儿染色体非整倍体无创产前游离DNA检测参考物质,以满足临床实验室的迫切需要。在本研究中,我们首先培养了母亲染色体正常、胎儿为21、18、13染色体三倍体或三倍体阴性的母子配对细胞,分别提取出细胞核,然后利用DFF消化母亲细胞的细胞核,得到DNA产物用于模拟母亲游离DNA(D-cfDNA),再利用MNase消化相对应配对的胎儿细胞的细胞核,得到的DNA产物用于模拟胎儿游离DNA(M-cfDNA)。将得到的含有不同染色体三倍体的M-cfDNA按2.5%、5%、10%和20%梯度胎儿游离DNA百分比(fetal fraction,FF)分别掺入相应与之配对的母亲D-cfDNA,最后将双酶消化模拟游离DNA混合物加入至模拟人血浆制备成新型胎儿染色体非整倍体无创产前检测游离DNA参考物质。为评价该参考物质于不同方法学检测的适用性,本研究采用全基因组大规模平行测序、靶向测序以及单个DNA分子成像技术等基于不同原理的NIPT方法分别对其进行验证,同时我们还利用深度测序技术分析比较了参考物质样本和天然孕妇血浆样本的DNA片段化模式,进一步验证二者具有一致的生物学特征。结果显示,当新型参考物质样本的FF高于最低检测限时,其所含非整倍体类型均能被采用上述三种NIPT方法的四家临床实验室成功检测,且无假阳性结果报告,即所制备的新型参考物质样本能适用上述所有方法进行无创产前检测。基于Y染色体测得FF值与预期FF值线性拟合程度良好(R20.990),表明基于Y染色体方法能准确反映所制备参考物质样本中的FF呈线性递增,与预期结果相符,且基于X染色体FF值与基于SNP所测得FF值均与基于Y染色体FF具有较好的线性拟合程度(前者R20.999,后者R2=0.995),表明所制备的参考物质样本能适用多种FF测定方法对其进行检测评价。此外,深度测序分析显示,参考物质样本和天然孕妇血浆样本在二核苷酸组成分布、核小体保护峰以及转录起始位点(transcription start site,TSS)区域核小体占有率等生物学特征上具有高度一致性。综上所述,本研究成功制备了一种新型胎儿染色体非整倍体无创产前检测游离DNA参考物质,与其他现有的参考物质相比,其在体外易于大量获取、能精确定量且能适用基于不同检测原理的NIPT方法,能应用于临床实验室进行无创产前检测质量保证,为胎儿染色体非整倍体NIPT的标准化和规范化提供了必不可少的物质基础。此外,本研究也为其他领域如单基因遗传病等无创产前检测参考物质的制备提供了全新的思路和方法。

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