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费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)盐胁迫蛋白质组学的研究

【摘要】: 费氏中华根瘤菌(Sinorhizobium fredii)RT19是分白天津盐碱地的快生大豆根瘤菌,能在含0.6mol/LNaCl的TY培养基上生长。本文采用高分辨率的双向电泳技术,得到不同生长时期的蛋白表达谱,应用高效的ImageMaster2D软件进行图谱分析,结果显示:(1)从延滞期到稳定期的末期,所表达的蛋白数量由398个逐渐增加至516个,显示了细胞内的蛋白在不同生长期的动态表达水平。(2)不同生长期的RT19的蛋白表达数量和种类约有80%是相同的,证实RT19在正常的生理过程中大部分蛋白的表达是稳定的,即为持家蛋白(如A73)。采用高通量的质谱技术和生物信息学,分析了持家蛋白A73的一级结构和功能,初步鉴定为DNA修复蛋白RecN,对于RT19正常的遗传重组和重组修复都是必不可少的。 采用差异显示蛋白质组学方法,对对数生长期的RT19(培养20小时)在无盐和盐激5min、50min条件下的蛋白表达谱进行研究。结果表明,在无盐时,该菌株呈现的蛋白数目是481个。随盐激时间的延长,其蛋白质数目减少,分别是465个、424个蛋白质。RT19在盐激后,有82个差异蛋白出现,其中诱导表达的蛋白有26个,阻抑表达的蛋白有23个,表达量上调的蛋白有12个,表达量下调的蛋白点21个。而且不同的盐激时间还出现不同的差异蛋白,说明其细胞内存在复杂的应答盐激的蛋白质网络调控。应用MALDI-TOF/MS对26个盐激诱导蛋白进行分析,将获得的肽指纹图谱经数据库检索,初步确定了20个诱导蛋白的功能,其中包括与盐胁迫、γ-丁酰甜菜碱、脂多糖合成、代谢途径和信号传导等有关的酶。 为了探讨RT19抵御盐激和长期盐胁迫所需的整体调节因子的异同,应用差异显示蛋白质组学方法,分别对对数生长末期的RT19(培养28小时)在盐激和长期盐胁迫下的蛋白表达谱进行分析、研究。结果显示:RT19在长期盐胁迫下,有86个差异蛋白点出现,其中诱导表达的蛋白有25个,阻抑表达的蛋白有34个,表达量上调的蛋白有5个,表达量下调的蛋白点22个。应用MALDI-TOF/MS对30个盐胁迫蛋白进行分析,已初步确定17个诱导蛋白的功能,其中包括与盐胁迫相关的热激蛋白(GroES、Clp)、与代谢途径和信号传导等有关的酶,以及ABC转运蛋白、转录调节蛋白、RNA聚合酶的β亚基等。RT19在盐激后,会有84个差异蛋白出现,其中诱导表达的蛋白有25个,阻抑表达的蛋白有12个,表达量上调的蛋白有29个,表达量下调的蛋白点18个。而且不同的盐激时间还出现不同的差异蛋白。应用MALDI-TOF/MS分析,已初步确定25个诱导蛋白的功能,其中包括亲和溶质脯氨酸合成必需的酶、ABC转运蛋白、热激蛋白(Hsp60)、DnaK及蛋白合成的伸长因子EF-Tu、与代谢途径、信号传导和电子传递系统有关的酶。通过对RT19的盐激和盐胁迫诱导蛋白的比较分析,发现:其中12个蛋白在两种不同的胁迫条件下都可被诱导表达。进一步证实:RT19应答不同盐胁迫刺激采取了不同的反应机制,但这些机制存在共性,交织成复杂的调控网络。 根据差异蛋白质组学的分析和鉴定,发现RT19在盐激和盐胁迫条件下,参与脂多糖的核心成分L-丙三醇-D-甘露庚糖生物合成的两个关键的酶:腺酐二磷酸-L-丙三醇-D-甘露庚糖-6-变位酶和甘露糖转移酶,分别被不程度地诱导。采用SDS-PAGE电泳,对RT19在不同盐激和盐胁迫 条件下的脂多糖进行分离,发现RT19的脂多糖的组成发生了显著的变化,并且,盐激导致的脂 多糖组成的变化比盐胁迫明显。差异蛋白质组学的分析结合代谢物的研究是探讨RT19耐盐机制 的新尝试。

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