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鱼总淋巴细胞群和CD4+T淋巴细胞亚群转录组学及补体C1qAgD蛋白晶体结构的研究

【摘要】:鱼类作为最低等的脊椎动物,是免疫学进化树上的节点动物,既具有先天性免疫系统又出现了获得性免疫系统,具有完整的体液和细胞免疫应答。鱼类中也存在T淋巴细胞和B淋巴细胞,其中T淋巴细胞也可以被分为CD4+T细胞和CD8+T细胞;而且,硬骨鱼B细胞普遍具有吞噬功能。但是迄今为止,仍然缺少有关鱼类T、B淋巴细胞增殖与激活及代谢通路的实质性研究。本文以硬骨鱼-草鱼和斑马鱼为研究对象,首先用Con A和LPS刺激草鱼淋巴细胞,应用Illumina/Hiseq测序平台进行了转录组测序;随后制备了抗CD4分子的单克隆抗体,对CD4+ T细胞进行了转录组测序与免疫相关基因的验证以及信号通路分析。最后,解析了斑马鱼C1qA头区(C1qA globular domain,C1qAgD)的晶体结构,从结构水平上阐明了 C1qAgD分子识别配体的作用机理。本文将草鱼外周血淋巴细胞分为对照组、ConA刺激组和LPS刺激组三组,用ConA和LPS刺激、培养12小时后,分别提取各组总RNA,获得了草鱼外周血淋巴细胞三大转录组数据。通过有参转录组数据库的分析与筛选,总共对442条草鱼免疫相关基因进行了注释。Con A刺激筛选到了 77个差异表达基因,其中包括71个上调基因和6个下调基因。KEGG富集分析表明了这些基因在不同KEGG通路中的富集程度。本文对富集最显著的3条免疫相关信号通路:JAK-STAT信号通路、MAPK信号通路和TNF信号通路进行了具体分析,这些基因参与了 T细胞的代谢、增殖和分化过程。LPS刺激组筛选到了 557个差异表达基因,其中包括433个上调基因和124个下调基因,KEGG富集分析表明其富集在最显著的免疫相关信号通路:吞噬体/溶酶体通路、NLR信号通路、TLR信号通路和JAK-STAT信号通路。这些基因在炎症反应、抵抗病原微生物感染及细胞的代谢、增殖和分化过程中发挥着重要作用。进一步对草鱼CD4蛋白功能区进行表达和纯化,成功制备了 6株抗草鱼CD4分子的单克隆抗体。Western blot检测结果表明,这6株单克隆抗体均可以特异性的识别草鱼CD4蛋白。随后,本文分离了草鱼头肾淋巴细胞,用Con A刺激和培养18小时后,采用纯化后的CD4单克隆抗体、结合流式细胞分选技术对对照组和Con A刺激组中的CD4+ T细胞进行了分离。通过分别提取CD4+T细胞和对照组的总RNA,成功构建了草鱼头肾CD4+T细胞转录组数据库。数据分析表明,ConA刺激草鱼头肾CD4+T细胞后共筛选到1718条差异表达基因,包括881个上调基因和837个下调基因。KEGG富集分析表明,富集最显著的免疫相关信号通路主要包括蛋白酶体通路、TLR信号通路、p53信号通路、JAK-STAT信号通路和MAPK信号通路。与ConA刺激外周血淋巴细胞相比,由于延长了刺激时间,使得Con A对头肾CD4+ T细胞信号通路的作用更为广泛。近年来,在低等脊椎动物如硬骨鱼中也发现了 C1q分子,但是关于它们的研究仍然处于基因结构和功能的水平上,而关于其蛋白结构方面的研究仍有待进行。本文采用蛋白体外表达、复性、纯化和结晶技术解析了斑马鱼C1qAgD(Dare-C1qAgD)分子的晶体结构。结果表明Dare-C1qAgD是以同源三聚体形式存在,虽然它与其它C1q家族分子的氨基酸同源性较低,但是它们具有相似的拓扑结构。通过结构分析,认为疏水性作用力是维持C1q分子由低等到高等生物进化过程中维持其拓扑结构不变的关键因素。与人类C1qAgD(hC1qAgD)进行结构和序列比对发现,它们氨基酸序列之间的同源性为38%,而它们结构上的主要差异在于loop环。hC1qAgD识别CRP的位点只有个别保守存在于Dare-C1qAgD中,并且Dare-C1qAgD缺失识别IgG的位点,这可能与鱼类中没有IgG有关。通过对Dare-C1qgD的结构进行模建,分析Daare-C1qgD和hC1qgD的表面电荷差异,本文认为这种表面带电性可能与C1q分子识别机制有关。综上所述,本文应用Illumina/Hiseq转录组测序平台对草鱼总淋巴细胞群和CD4+T淋巴细胞亚群增殖与激活相关的代谢通路进行了研究,结果为研究草鱼淋巴细胞激活与分类提供了重要的细胞表面标志。Daare-C1qAgD蛋白晶体结构的解析结果展示了硬骨鱼中C1q分子结构上的保守性和差异性,证实了免疫分子在进化过程中的细微变化与其结合多样性配体密切相关。

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