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苜蓿异黄酮和缩合单宁代谢路径调控及异黄酮转运蛋白筛选

【摘要】:异黄酮和缩合单宁属于类黄酮物质,是牧草的重要活性成分,对于反刍动物有特殊营养价值。异黄酮具有微弱的雌激素活性,作用于激素受体,也能提高动物免疫力,进而提高动物生产性能。缩合单宁是多酚类物质,具有较强的蛋白结合能力,能够减缓蛋白质消化速率,一定浓度的缩合单宁可有效预防反刍动物膨胀病的发生。然而,苜蓿被采食部位的异黄酮和缩合单宁含量很低,不能满足畜牧需求。因此,提高苜蓿叶片中异黄酮和缩合单宁含量一直是牧草研究的重要课题。本论文从异黄酮的“源”和“库”两方面进行研究。一方面,通过多基因聚合育种,从“源”上调控类黄酮代谢路径,创制异黄酮及缩合单宁含量都提高的转基因苜蓿新种质。另一方面,期望通过光亲和标记技术寻找异黄酮转运蛋白,阐释异黄酮转运贮藏机制。本研究选取多个关键基因,对截形苜蓿的异黄酮代谢进行修饰和改造:表达GmIFS1,增强异黄酮合成能力;表达上游关键基因GmCHS7、GmCHI1A,增加异黄酮的前体物质供应;干扰截形苜蓿内源MtF3H,减少花青素、黄酮醇等支路的分流作用。将GmIFS1、GmCHS7、GmCHI1A过表达载体、MtF3H干扰载体进行组合,得到四种不同的植物表达载体。通过农杆菌介导的遗传转化获得了截形苜蓿转基因植株,qRT-PCR、Western blotting筛选到GmIFS1、GmCHS7、GmCHI1A高表达、MtF3H下调表达的T3代稳定遗传株系。与野生型相比转基因株系生长发育没有发生显著变化。经过LC-UVS、LC-ESI-MS鉴定,转基因材料的叶片中染料木素、芒柄花素、鹰嘴豆素A等异黄酮含量显著增加,同时还新发现了一种在苜蓿叶片中不常见的异黄酮—大豆苷元。定量分析发现,转基因材料的叶片总异黄酮增量显著,最高可达1962.95 ±606.33 nmol/gFW,是野生型材料的27.5倍。其中,同时表达GmIFS1、GmCHS7、GmCHI1A的转基因组合不仅异黄酮含量增加,其缩合单宁含量也显著提高,最高达0.34 mg/gFW,是野生型的1.4倍。本研究获得了异黄酮和缩合单宁含量都显著提高的截形苜蓿转基因优异株系。异黄酮的合成、储存和分泌通过转运蛋白介导的异黄酮运输紧密联系,然而该方面的研究还十分有限。为了寻找异黄酮转运蛋白,本研究设计并合成了大豆苷元衍生的二苯甲酮型光亲和标记探针PADA。结果表明,光亲和标记反应使PADA与黄酮/异黄酮糖基转移酶UGT78G1发生共价交联,并且该交联过程被大豆苷元竞争抑制,说明合成的探针PADA能够标记与异黄酮结合的蛋白,并且该标记是特异的。同时,不以异黄酮为底物的GmCHI1A、MtF3H等蛋白,均不能与PADA发生光亲和标记反应,这进一步证实,PADA内部的异黄酮残基与目的蛋白的结合能力决定探针的特异性。以上结果表明,本文合成的PADA是高效且特异的光亲和标记探针。本研究进一步利用光亲和标记技术与生物素亲和纯化技术,建立了异黄酮结合蛋白的分离、富集体系,并利用探针PADA从大豆根部膜蛋白初步分离富集到异黄酮结合蛋白,通过高分辨率质谱分析获得了 PADA结合蛋白组信息,为进一步研究异黄酮转运机制奠定基础。本研究获得了苜蓿高异黄酮、高缩合单宁转基因新种质,通过转基因材料分析了类黄酮的代谢流向,为牧草育种提供新思路和新策略。本研究合成的PADA光亲和标记探针,为寻找异黄酮转运蛋白以及异黄酮转运机制研究提供了重要信息。

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