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miR-362在非小细胞肺癌转移中的作用及分子机制

【摘要】:系统生物学是研究生物系统中所有组成成分(基因、mRNA、蛋白质等)的构成,以及在特定条件这些组分间的相互关系的学科。本课题是研究某一基因改变后其上游、下游分子在生物系统内的改变,研究整体的变化情况。肺癌是世界范围内严重影响人们健康的恶性肿瘤之一,最新的统计结果表明,肺癌死亡率已居恶性肿瘤中首位,而肺癌的发病率和死亡率仍呈上升趋势。其中非小细胞肺癌(non-small-celllungcancer,NSCLC)约占肺癌的85%。近年来,随着包括手术切除、化疗、放疗及生物治疗等手段的综合应用,NSCLC患者的生活质量和生存期均有明显的改善,但患者的5年生存率仍然不高,其原因与NSCLC的转移密切相关,约40%的I期和60%的II期NSCLC死亡患者均具有远端转移。因此,研究NSCLC侵袭转移的分子机制,阐明其作用机理,不仅有助于深入了解NSCLC在疾病演进中的分子变化,而且还有助于提高患者的生存期。恶性肿瘤的转移是一个涉及多个水平(如基因、蛋白等)、多个分子的共同作用的结果。随着基因组测序的完成,近年来非编码基因在肿瘤发生发展中的作用受到密切的关注。MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性微小RNA分子,其通过转录后水平调控蛋白的表达。研究表明miRNAs在癌症的发生发展中发挥着重要的作用。我们前期研究结果表明,miR-362在NSCLC组织中高表达,然而该分子在NSCLC中的作用尚不明确。本文中的研究是复杂生物系统里的组成部分,是对整体系统理论研究的一个重要补充。本文通过t检验方法分析正常组与miR-362基因敲除组间各参数差异的显著性;结合细胞体外实验中对多组数据的单因素方差分析,探讨了 miR-362在NSCLC转移中的作用及其机制。研究目的探讨miR-362在NSCLC转移中的作用及其机制。研究方法运用CRISPR/Cas9基因编辑技术,建立miR-362基因敲除的A549、95-D肺癌细胞株;利用transwell分析miR-362对细胞侵袭、迁移能力的影响;用克隆形成实验研究miR-362对细胞克隆形成能力的影响;利用流式细胞术检测miR-362对细胞周期、细胞凋亡的影响;通过小鼠体内实验评估miR-362对肿瘤生长的作用;利用生物信息学方法结合分子生物学手段检测miR-362的下游靶基因,并评估该靶基因对NSCLC细胞生物学行为的作用;免疫组织化学法检测NSCLC与癌旁组织中miR-362靶基因的表达水平并与miR-362的表达水平进行相关性分析。结果1、miR-362在NSCLC组织与细胞系中高表达。与癌旁的正常组织相比,miR-362在NSCLC组织中高表达(p=0.0498),miR-362与患者手术切除后肿瘤的复发时间密切相关(p=0.0454);miR-362在NSCLC细胞系(A549、95-D、NCI-H1299、NCI-H292和NCI-H460)中高表达;2、miR-362在体外可促进NSCLC的侵袭、迁移、克隆形成,体内促进小鼠肿瘤的形成。成功构建了miR-362基因敲除细胞系A549KO和95-DKO;与野生型细胞相比,A549KO细胞的细胞侵袭、迁移能力分别下降了48.68%(p=0.0003)和51.56%(p=0.0005);细胞克隆形成能力降低了 47.78%(p=0.0005);95-DKO细胞的细胞侵袭、迁移能力分别下降了30.45%(p=0.0001)和33.23%(p=0.0002);细胞克隆形成能力降低了30.56%(p=0.0153);细胞体内成瘤实验中miR-362敲除后肿瘤增长能力显著降低(p0.0001);细胞周期、细胞凋亡率无显著性差异;3、发现并确定了miR-362直接作用靶基因SEMA3A及其功能。生物信息学结合分子生物学分析结果表明SEMA3A是miR-362的直接作用靶基因;含SEMA3A全长编码区的载体转染A549细胞后,细胞侵袭、迁移能力分别下降61.64%(p= 0.0006)和75.90%(p= 0.0002),细胞克隆形成能力下降了56.77%(p=0.0016),转染95-D细胞后,细胞侵袭、迁移能力下降61.29%(p=0.0005)和70.29%(p=0.0023),细胞克隆形成能力下降了63.39%(p0.0001);4、免疫组化结果显示SEMA3A在癌旁组织中高表达,与miR-362表达呈负相关。结论利用CRISPR/Cas9系统成功构建了 miR-362基因敲除的A549和95-D细胞系;miR-362在NSCLC中高表达,具有促进NSCLC转移、克隆形成以及体内成瘤的作用;miR-362靶向SEMA3A,通过负调控SEMA3A的表达促进肿瘤转移;miR-362/SEMA3A阐明了NSCLC侵袭和迁移的分子机制,为NSCLC治疗提供了新的潜在治疗靶点。本文取得的创新性成果主要有:1.本研究采用了CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术,通过同源重组途径,并结合Cre/LoxP系统首次构建了miR-362敲除的A549KO和95-DKO细胞株,为进一步建立A549/95-D的其他基因敲除细胞系提供了参考;2.证明miR-362在体外可促进NSCLC的侵袭、迁移、克隆形成,体内敲除miR-362可促进化疗药物抑制肿瘤增殖的敏感性,为进一步研究miR-362在NSCLC中的作用机制和功能奠定了基础;3.发现并确定了miR-362直接作用靶基因SEMA3A;4.miR-362/SEMA3A解释了 NSCLC侵袭和迁移的的分子机制之一,为NSCLC治疗提供了新的潜在治疗靶点。综上所述,依托多种数理统计方法,本研究发现miR-362在NSCLC组织中高表达,该分子通过下调SEMA3A的表达,促进NSCLC的转移。本研究为阐明NSCLC转移提供了新的机制,为NSCLC治疗提供了新的潜在治疗靶点。

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